واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

سنوضح في هذا الفيديو كيفية تحضير وتوصيف طبقات ليبيدية ثنائية مستوية مدعومة وموظيفة حيويًا. كما سنصف بالتفصيل بنية مجهر الانعكاس الداخلي الكلي المزود بقدرات كشف الجزيئات المفردة. وسنقوم بقياس كثافة قدرة الاستثارة، والسيولة، وكثافة البروتين في الطبقة الليبيدية.

لنبدأ بمقدمة قصيرة عن الطبقات الدهنية المزدوجة المدعومة بزجاج مستوٍ. عندما تصطدم الحويصلات الدهنية أحادية الطبقة الصغيرة بسطح زجاجي نظيف، فإنها تنفجر وتنتشر لتشكل طبقة دهنية مزدوجة متصلة. وعادةً ما نختار مادة البالميتات كركيزة مائية.

يعتبر أوليو فوسفوكولين أو POPC هو الليبيد السائد لأنه يكون طبقات ليبيدية ثنائية مائعة في درجة حرارة الغرفة وعند 37 درجة مئوية. ولغرض الوظيفية، نضيف نيكل أنتيوكس (nickel antiox)، وهو ليبيد اصطناعي يحتوي على مجموعة رأس مخلبية للنيكل، والتي ترتبط بالبروتينات ذات علامة متعدد الهيستيدين (poly histamine tag). على سبيل المثال، الجزيء المحفزร่วม B7-1، وجزيء الالتصاق ICAM-1، وجزيء MHC المحمل بالببتيد والموسوم فلوروسنتياً للتعرف على الخلايا التائية كما هو موضح هنا؛ ومع ذلك، يمكن استخدام نظام الطبقة الثنائية هذا من حيث المبدأ لمعالجة عمليات مختلفة تماماً في مجموعة متنوعة من الأنظمة البيولوجية.

نظرًا لطبيعة النظام المستوي، يمكن مراقبة أحداث الفلورة في وضع الانعكاس الداخلي الكلي، وهو ما يقلل بشكل كبير من الخلفية الخلوية ويجعله مناسبًا جدًا لمجهر الفلورة للجزيء الواحد. لتحضير الدهون، يحتاج المرء إلى الدهون، POPC والنيكل في الكلوروفورم، ودورق نظيف ذو قاع مستدير؛ يتم إذابة الدهون بالنسب المطلوبة في الكلوروفورم وتجفيفها تحت الفراغ كما هو موضح هنا. بعد المعالجة بالفراغ العالي طوال الليل، تشكل الدهون غشاءً على الجدار الداخلي للدورق. لإعادة ترطيب الدهون، استخدم PBS منزوع الغاز بإضافة 10 milliliters من الـ PBS منزوع الغاز إلى خليط الدهون المجففة.

لا تقم بالخلط. والآن، ولتجنب أكسدة الدهون، املأ الدورق بغاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون ثم قم بتدوير الدورق. ستشكل الدهون معلقاً حليبياً.

خذ عينة صغيرة لتكون بمثابة عينة فارغة (blank) لجهاز spectrophotometer لمنع تبادل الغازات خلال الخطوة التالية. من المهم جداً إغلاق الدورق الذي يحتوي على المعلق الدهني بإحكام. استخدم شريطاً لاصقاً مقاوماً للحرارة، مثل autoclave tape، لتوفير الحماية من الهواء أثناء التكوين الفيزيائي باستخدام حمام ultrasonic مغلق.

بعد تثبيت الدورق، ابدأ إجراء الموجات فوق الصوتية بقدرة قصوى تبلغ 170 watts. استمر في عملية السونيكة لمدة 60 minutes. وبسبب التكوين الفيزيائي، انخفضت العكرية بشكل ملحوظ.

يمكن التحقق من ذلك عن طريق القياس الطيفي الضوئي عند 550 نانومتر. استخدم الجزء الذي تم أخذه قبل عملية السونكة كعينة فارغة. يجب أن تظل الكثافة الضوئية عند 230 نانومتر، والتي تشير إلى كمية الدهون، ثابتة.

نقوم هنا بملء أنابيب طرد مركزي فائقة صغيرة بكمية 1 mL من المعلق الحويصلي ونضعها في دوّارة ذات زاوية ثابتة في جهاز طرد مركزي فائق مكتبي. من المهم جداً استخدام الحويصلات أحادية الطبقة الصغيرة فقط لتحضير الطبقة الثنائية؛ حيث إن الحويصلات متعددة الطبقات الأكبر والأكثر كثافة، والتي تتكون أيضاً أثناء عملية السونكة، تتدخل في سيولة الطبقة الثنائية، وبالتالي يجب ترسيبها وإزالتها عن طريق الطرد المركزي.

أولاً، نقوم بالتدوير لمدة ساعة واحدة عند 150,000 G في درجة حرارة الغرفة. ثم يتم طرد السنات (snat) الناتج مركزياً لمدة ثماني ساعات إضافية عند 288,000 G في درجة حرارة أربع درجات مئوية. يجب أن تكون الشرائح الزجاجية نظيفة جداً قبل أن تتمكن الحويصلات الدهنية من الانتشار عليها لتكوين طبقة ثنائية متصلة وسائلة.

لهذا الغرض، نضع شرائح التغطية في كومة من التيفلون، والتي نضعها بعد ذلك في وعاء زجاجي. يجب توخي الحذر الشديد وارتداء واقي العينين، وقفازات الحماية، ومعطف المختبر، والعمل داخل خزانة المواد الكيميائية. نضيف جزءاً واحداً من بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 30%، ثم ثلاثة أجزاء من حمض الكبريتيك المركز لإنتاج حمض البيرومونوسلفوريك شديد التفاعل والمؤكسد.

يتفاعل هذا الخليط بعنف مع المواد العضوية، بما في ذلك تلك الموجودة في الجلد والعينين والملابس، حيث ترتفع درجة حرارته فوراً. قم بتحضين الشرائح لمدة 30 دقيقة.

أمسك غطاء الشريحة باستخدام ملقط. اغسل الحمض جيدًا عن كلا جانبي غطاء الشريحة النظيف باستخدام W distilled أو مياه غير متأينة عالية الجودة. ثم ضع الشريحة على حامل Teflon واتركها تجف لمدة لا تزيد عن 10 دقائق لتتمكن من إنتاج عدة طبقات ليبيدية ثنائية فردية في وقت واحد. نقوم بلصق أغطية الشرائح المجففة باستخدام مادة تصلب سريعة.

غراء إيبوكسي مكون من جزأين سواءً في غرفة Lab Tech ذات ثماني آبار أو 16 بئراً. أولاً، قم بإزالة شريحة الزجاج الأصلية بعناية من إطارها. اخلط مكوني الغراء بنسبة واحد إلى واحد.

وزّع الغراء بالتساوي في الأخاديد السفلية لإطار الحجرة. ضع غطاء الشريحة النظيف فوق الجزء السفلي من إطار الحجرة المغطى بالغراء. تأكد من توزيع الغراء بالتساوي بين الشريحة الزجاجية والإطار البلاستيكي.

اترك الغراء ليتصلب لمدة 30 دقيقة. خفف المعلق الفيزيائي للدهون في محلول PBS بنسبة 1 إلى 10، وقم بترشيحه عبر مرشح بمسامية 0.2 ميكرون، ثم أضف 120 microliters من هذا التخفيف إلى كل بئر في غرفة ذات ثماني آبار، أو 60 microliters إلى كل بئر في غرفة ذات 16 بئراً. تأكد من تغطية كامل السطح الزجاجي وانتظر لمدة 20 دقيقة.

لقد تشكلت الآن الطبقة الثنائية. للتخلص من الرواسب، اشطف كل بئر بـ 30 milliliters من PBS. تجنب تعريض السطح الزجاجي للهواء بأي ثمن؛ لأن ذلك سيؤدي إلى تدمير الطبقة الثنائية على الفور. ولضمان احتواء كل بئر على نفس الحجم من المنظم، املأ كل بئر بالكامل ثم أزل القبة السائلة تمهيداً لخطوة تزيين البروتين التالية.

اسحب 330 µL. سيترك هذا حوالي 350 µL في كل بئر. ولتزيين الطبقة الثنائية بالبروتينات، قم بتحضير خليط رئيسي يحتوي على بروتينات poly histamine المختارة، وأضف 50 µL منه إلى كل بئر.

ترتبط البروتينات بمجموعة الرأس المضادة للنيكل للدهون الداكنة لضمان الحصول على نتائج قابلة للتكرار؛ اخلط المكونات جيداً ولكن بحذر، وقم دائماً بالتحضين لمدة 60 دقيقة لإزالة البروتينات غير المرتبطة. اغسل مرة أخرى باستخدام 30 milliliters من PBS. لنركز الآن على أجهزة المجهر.

أولاً، سنوضح متطلبات مجهر الانعكاس الداخلي الكلي للتصوير المجهري للسطح المعتمد على العدسة الشيئية. يتطلب الأمر عدسة شيئية غمر زيتية ذات فتحة عددية عالية. يتم عكس شعاع إثارة الليزر الوارد بواسطة مرآة ثنائية اللون وتركيزه عبر مجموعة من عدستين أو ثلاث عدسات على المستوى البؤري الخلفي للعدسة الشيئية فقط.

بعد ذلك، يوجه ضوء الليزر العدسة الشيئية كحزمة متوازية على طول المحور البصري. وبهذه الطريقة، يتم إضاءة العينة الفلورية على كامل عمقها. وعندما تقوم بنقل الحزمة بشكل عمودي على المحور البصري، تظل الحزمة متوازية، ولكنها تخرج من العدسة الشيئية بشكل مائل.

إذا استمررت في الإزاحة، فستصل في مرحلة ما إلى الزاوية الحرجة التي ينعكس عندها الشعاع كلياً عند الواجهة الفاصلة بين غطاء الشريحة الزجاجي والعينة. وتضمحل شدة الموجة المتلاشية الناتجة بشكل أسي، بحيث لا يتم استثارة سوى الجزيئات الموجودة في الجوار المباشر للواجهة الفاصلة وصولاً إلى عدة مئات من النانومترات. والآن، سنوضح كيفية تركيز شعاع الليزر يدوياً في المستوى البؤري الخلفي للعدسة الشيئية.

عند استخدام ثلاث أو عدستين، يتم زيادة قطر شعاع الليزر بواسطة العدستين الأوليين. وتحدد نسبة البعد البؤري لهما حجم بقعة الإضاءة عند مستوى العينة. ولضمان بقاء الشعاع متوازياً، يتم ضبط المسافة بين هاتين العدستين بحيث تساوي مجموع البعدين البؤريين.

تُستخدم العدسة الثالثة لتركيز الشعاع العريض في المستوى البؤري الخلفي للعدسة الشيئية. ونظراً لأن الطول البؤري لهذه العدسة يجب أن يتناسب مع أبعاد جسم المجهر وأبعاد البيريسكوب المرتبط به، فيجب أن يكون أطول بكثير في حالتنا هذه، وبقيمة متغيرة تصل إلى 75 سنتيمتراً. ولا تؤثر المسافة بين العدستين الثانية والثالثة على خصائص الشعاع.

وبناءً على ذلك، يمكن استخدام المساحة اللانهائية الموجودة في الوسط لتعديل الحزمة بطريقة محددة دون حدوث تشوهات. فعلى سبيل المثال، يمكنك إدراج فتحة إسقاط والإسقاط بدقة على مستوى العينة. وجوهر الأمر هو أنه يمكنك تحقيق النتيجة ذاتها باستخدام عدستين بدلاً من ثلاث.

يعتبر نظام العدستين أقل تحديداً ولكنه يسبب زيغاً عدسياً أقل. ولا تزال الميزات البسيطة مثل الفتحة قابلة للتنفيذ بشكل جيد جداً للتعديل الزمني. يجب وضع ليزر غازي أو حديدي أو ليزر الحالة الصلبة أمام غالق يعمل في نطاق الميلي ثانية، على سبيل المثال، غالق ميكانيكي أو معدل بصري.

ويُعد ليزر الصمام الثنائي بديلاً جيداً، حيث يمكن تعديله إلكترونياً ولا يحتاج إلى إغلاق خارجي. ويكفي استخدام مرآتين لتوجيه الشعاع إلى أي مكان وفي أي اتجاه. وكما نوقش سابقاً، تُستخدم العدستان لتوسيع الشعاع وتركيزه على المستوى البؤري الخلفي لعدسة المجهر الشيئية.

يمكننا نقل الحزمة من أجل تكوين العشب عن طريق إزاحة المرآة السفلية للميريسكوب على سكة بصرية. وللكشف عن الصورة، نستخدم كاميرا عالية الحساسية؛ على سبيل المثال، جهاز اقتران شحني مضاعف للإلكترونات أو em CCD. كما يمكن محاذاة حزمة ليزر ثانية بطول موجي مختلف ضمن مسار الحزمة.

باستخدام المرايا وطبقة تراكبية ثنائية اللون (dichroic overlay). ومن أجل الكشف المتزامن بلونين، نضع جهاز تقسيم شعاع متوفر تجارياً في مسار الانبعاث. كما أنه من المفيد جداً في التجارب وجود مسارين مستقلين لشعاع الإثارة.

على سبيل المثال، يتم تخصيص مسار واحد للتصوير العام (turf imaging) ومسار ثانٍ للتبييض الضوئي المستهدف أو التنشيط. ويمكن تحقيق ذلك بسهولة من خلال تنفيذ مجموعة من مقسمات الحزمة 50 50 عدد 2. وكما هو موضح في الرسم التوضيحي، فإن نظامي ضبط للعدسات والمرايا سيعطيان ملفين تعريفِيّن وزاويتين منفصلتين للحزمة.

على سبيل المثال، يتم استخدام فتحة واسعة للتصوير في المناطق العشبية (turf)، وأخرى أكثر تركيزاً لعمليات التبييض أو التنشيط في المناطق غير العشبية. كما يمكن وضع فتحة (aperture) في مسار الحزمة غير العشبية لتشكيل بقعة التبييض أو التنشيط بدقة. ويتيح وجود غالقَين إضافيين، واحد لكل مسار حزمة، تحكماً مستقلاً في تشغيل شعاع الليزر، مما يبقي العدسة الشيئية في مسار مستقيم غير مائل.

قم بتشغيل مقياس الطاقة وضبطه على الطول الموجي المقابل لليزر. قم بقياس قدرة ضوء الليزر عند الشيئية وسجل القيمة. الآن، قم بنقل المرآة الموجودة خلف المجهر لإمالة شعاع الليزر عند الشيئية إلى وضع العشب.

لا تنظر أبداً بشكل مباشر إلى ضوء الليزر. يمكنك رؤية ملف الكثافة لليزر الاستثارة في الزاوية اليمنى السفلية، كما تم تصويره من خلال انبعاث طبقة ثنائية مزينة ببروتينات فلورية. نستخدم هنا تمثيلاً بالألوان الزائفة لتسليط الضوء على المناطق ذات الكثافات المختلفة.

قس متوسط شدة الخلفية ضمن منطقة اهتمام كبيرة بما يكفي. تعتمد هذه القيمة على إعدادات محددة للكاميرا مثل كسب EM وسرعة القراءة، ويجب طرحها من جميع شدات القياس. حدد متوسط الشدة ضمن كامل المنطقة المضاءة.

اختر قطراً كبيراً بما يكفي بحيث تكون قيم الشدة عند المحيط مماثلة لقياس خلفية الكاميرا، ثم قم بقياس متوسط الشدة في المنطقة المركزية. تحدد هذه المنطقة منطقة الاهتمام التي ستُجرى فيها تجارب المجهر لاحقاً. الآن، اطرح قيمة متوسط شدة الخلفية من شدة كل من المنطقة المستبعدة والمنطقة المركزية.

بعد ذلك، اضرب شدة الإضاءة المصححة للخلفية في عدد البكسلات المقابل لحجم المنطقة للوصول إلى الشدات المتكاملة. عيّن الشدة المتكاملة للمنطقة المضاءة كقيمة واحد واحسب الكسر للمنطقة المركزية. تُقاس القدرة باستخدام مقياس القدرة.

في حالتنا هذه، تتناسب خمسة milliwatt تناسباً طردياً مع الكثافة المتكاملة لكامل المنطقة المضاءة. اضرب هذه القيمة في كسر القدرة للمنطقة المركزية لتحديد القدرة داخل المنطقة المركزية. وفي مثالنا، تبلغ هذه القيمة 1.15 milliwatt، ويعتمد العامل المستخدم لتحويل عدد البكسلات إلى ميكرومتر مربع على الحجم الفعلي للبكسل في شريحة الكاميرا وتكبير مسار الانبعاث.

يمكن تحديد ذلك بسهولة باستخدام شريحة ميكرومترية. في مثالنا، تعادل المنطقة المركزية 170.8 ميكرون مربع. تشير كثافة القدرة إلى القدرة المقاسة مقسومة على المساحة، وبالتالي تساوي 1.15 ميلي واط مقسومة على 170.8 ميكرون مربع، أو 0.007 ميلي واط لكل ميكرون مربع.

وهذا يعادل 0.7 Kilowatt لكل سنتيمتر مربع. ولتحديد سيولة الطبقة الثنائية، نقوم بإجراء تجربة استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي. وكما هو موضح في الفيديو أسفل اليسار، نقوم بتصوير الطبقة الثنائية الفلورية عند كثافة طاقة منخفضة.

في المقطع المرئي الموجود في أسفل اليمين، يمكنك رؤية غرفة الفني المختبري المقابلة على المجهر. نقوم بعد ذلك بتبييض منطقة دائرية باستخدام نبضات قصيرة ذات كثافة طاقة عالية، ونراقب التعافي عند كثافة طاقة منخفضة. مرة أخرى، توفر المجموعة نظرة عامة على التجربة لنقاط زمنية مختلفة، حيث يمثل الزمن صفر نبضات التبييض.

نقوم بقياس متوسط شدة الفلورة المصححة للخلفية داخل الدائرة المحددة، ونقوم بتنميط جميع الشدات المقاسة بالنسبة للشدة في بداية التجربة. وقبل نبضات التبييض، نرسم قيم الشدة المنمطة مقابل الزمن. وتمثل قيمة التشبع في حالتنا الكسر المتحرك بنسبة تزيد عن 90%. أولاً، التقط صورة للطبقة الثنائية بكثافة قدرة إثارة منخفضة.

على سبيل المثال، من خلال وضع مرشح كثافة بصرية بقيمة توهين لوغاريتمية قدرها اثنان، يتم تقليل القدرة بمعامل 100. يجب أن يكون وقت التعريض ثابتاً طوال الإجراء بالكامل وكافياً لتصوير قوة سائل واحدة عند كثافة القدرة غير الموهنة، وفي حالتنا هذه، 10 milliseconds عند 0.7 kilowatt per square centimeter. استخدم تمثيل الألوان الزائفة لتمييز المناطق ذات الشدات المختلفة.

اختر منطقة اهتمام واحدة سيتم إجراء قياسات الجزيء الواحد فيها لاحقاً ومنطقة أخرى بنفس الحجم. ولطرح الخلفية، احسب شدة التكامل بعد طرح الخلفية. الآن قم بإزالة مرشح الكثافة الضوئية من مسار شعاع الإثارة، وقم بتبييض المنطقة ثم التقط صورة.

سوف تلاحظ انتشار جزيئات مفردة من الـ flu force في المنطقة المبيضة. تكون الـ Single flu force محدودة بالحيود بقطر نموذجي يتراوح من بكسلين إلى ثلاثة بكسلات؛ قم بأخذ منطقة بمساحة 7 × 7 بكسل حول إشارة كل جزيء مفرد ومنطقة ثانية مجاورة لها. ولغرض طرح الخلفية، من المهم قياس إشارة الـ single Fluor force فقط.

لذلك، يفضل تصوير البروتينات في طبقة BI بنسبة مادة صبغية إلى بروتين أقل من واحد، أو بالنسبة للبروتينات المحددة بـ SAT بشكل خاص. وبنسبة مادة صبغية إلى بروتين تصل إلى واحد كما هو موضح في مثالنا، يتم قياس الكثافات المتكاملة لكلا المنطقتين وطرح الخلفية من الإشارة؛ مع عدم احتساب الحدث الأخير المرصود الموضح في مثالنا نظراً لاحتمال حدوث بهتان أثناء التعرض المتوسط. الإشارات المصححة هنا، نقوم بهذا الإجراء لواحد من أربعة، والذي نرصده عبر تسعة إطارات.

ومع ذلك، يجب تنفيذ هذا الإجراء لعدة مئات من أحداث الجزيئات المنفردة على الأقل. لنعد إلى صورة الطبقة الثنائية الأصلية التي رُصدت عند كثافة قدرة إثارة مُخففة. يتم تحديد الكثافة الجزيئية عن طريق تصحيح الشدة المتكاملة لمنطقة الاهتمام عند كثافة قدرة إثارة منخفضة، وذلك من خلال الضرب في مائة والقسمة على متوسط شدة الجزيء المنفرد والمساحة.

نتعامل هنا مع كثافة تبلغ 421.4 Fluor force لكل ميكرون مربع. في مثالنا، ومع نسبة غذاء إلى بروتين تبلغ واحد، فإن هذا يعادل نفس عدد الجزيئات لكل ميكرون مربع. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادرًا على تحضير وتوصيف طبقة دهنية ثنائية وظيفية البروتين باستخدام مجهر الفلورة للجزيء الواحد.

علاوة على ذلك، يجب أن تكون على دراية بالمبادئ الأساسية لتعديل وتطوير مجهر قياسي لهذا الغرض. سنستخدم هذه المنهجية لاحقاً لتحديد حركية ارتباط المستضد المرتبط بطبقة ثنائية بمستقبلات الخلايا التائية المرتبطة بالخلية، ولكن من المؤكد أن العديد من التطبيقات الأخرى القائمة على هذا المبدأ ممكنة التنفيذ.