واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

في هذا الفيديو ، سنوضح كيفية تحضير وتوصيف القناة الدهنية المستوية الوظيفية الحيوية المدعومة بالبلدر. سنصف أيضا بالتفصيل بنية مجهر الانعكاس الداخلي الكلي مع قدرات الكشف عن جزيء واحد. سنقيس كثافة قوة الإثارة والسيولة وكثافة البروتين في الدهون الدهونية.

لنبدأ بمقدمة قصيرة للزجاج المستوي المدعوم بالدهون blay. عندما تواجه الحويصلات الصغيرة أحادية اللانار سطحا زجاجيا نظيفا ، فإنها تنفجر وتنتشر لتشكل طبقة ثنائية دهنية متجاورة. على وسادة مائية ، نختار عادة مادة النخيل.

Ole phosphocholine أو POPC على الدهون السائدة لأنه يؤدي إلى ظهور طبقات ثنائية دهون سائلة في درجة حرارة الغرفة و 37 درجة مئوية. من أجل الوظيفة ، نضيف مضادات الأكسدة من النيكل ، وهي دهون اصطناعية مع مجموعة رأس مخلبية من النيكل ، والتي تربط بروتينات علامة بولي الهيستامين. على سبيل المثال ، جزيء التحفيز المشترك B سبعة واحد ، وجزيء الالتصاق ، و ICAM واحد ، وجزيء معقد التوافق النسيجي الكبير المحمل بالببتيد المسمى بالفلورسنت للتعرف على الخلايا التائية كما هو موضح هنا ، ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا النظام ثنائي الطبقة من حيث المبدأ لمعالجة عمليات مختلفة تماما في مجموعة متنوعة من الأنظمة البيولوجية.

نظرا لطبيعة النظام المستوي ، يمكن مراقبة أحداث التألق في وضع الانعكاس الداخلي الكلي ، مما يقلل من الخلفية الخلوية بشكل كبير وهو مناسب تماما للفحص المجهري الفلوري أحادي الجزيء لتحضير الدهون ، يحتاج المرء إلى الدهون ، POPC وكلوروفورم مضاد للأكسدة من النيكل ، وقارورة قاعية مستديرة نظيفة تذوب الدهون في النسبة المطلوبة والكلوروفورم وتجفيفها تحت الفراغ كما هو موضح هنا. بعد المعالجة بالفراغ العالي بين عشية وضحاها ، تشكل الدهون طبقة على الجزء الداخلي من القارورة. لترطيب الدهون ، استخدم Degas PBS عند 10 ملليلتر من Degas PBS إلى خليط الدهون المجففة.

لا تخلط. الآن لتجنب أكسدة الدهون ، املأ القارورة بغاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون ، وقم بتدوير القارورة. تشكل الدهون معلقا حليبي.

خذ عينة صغيرة كفارغة لمقياس الطيف الضوئي لمنع تبادل الغازات خلال الخطوة التالية. من المهم جدا إغلاق القارورة التي تحتوي على تعليق الدهون بشكل صحيح. استخدم شريطا لاصقا مستقرا للحرارة ، على سبيل المثال ، شريط الأوتوكلاف حيث يتم حماية الهواء أثناء التكوين المادي باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية المغلق.

بعد تركيب القارورة ، ابدأ إجراء الصوتنة بقوة قصوى تبلغ 170 واط. سونيك كيد لمدة 60 دقيقة. بسبب التكوين المادي ، انخفضت العكارة بشكل كبير.

يمكن التحقق من ذلك عن طريق القياس الضوئي الطيفي عند 550 نانومتر. استخدم الاقتباس المأخوذ قبل الصوتنة كفارغ. يجب أن تظل الكثافة البصرية عند 230 نانومتر ، وهو ما يدل على كمية الدهون ثابتة.

هنا نملأ أنابيب الطرد المركزي الصغيرة فائقة بتعليق واحد مليلتر ونضعها في دوار بزاوية ثابتة لجهاز طرد مركزي فائق المنضدية. من المهم جدا استخدام حويصلات أحادية لينا صغيرة فقط لإعداد الطبقة الثنائية. تتداخل حويصلات الطبقة المتعددة الأكبر والأكثر كثافة ، والتي تتشكل أيضا أثناء الصوتنة ، مع سيولة الطبقة الثنائية ، وبالتالي يجب أن تكون شاحبة وإزالتها عن طريق الطرد المركزي.

أولا ، ندور لمدة ساعة واحدة عند 150،000 جم في درجة حرارة الغرفة. ثم يتم الطرد المركزي للسnat الناتج لمدة ثماني ساعات إضافية عند 288،000 جم عند أربع درجات مئوية. يجب أن تكون الأضواء الزجاجية نظيفة جدا قبل أن تنتشر الحويصلات الدهنية عليها لتشكيل طبقة ثنائية متجاورة وسوائلة.

لهذا ، نضع زلات الغطاء في كومة تفلون ، ثم نضعها في تمرين وعاء زجاجي. توخي الحذر الشديد حيث حماية العين وحماية القفازات ومعطف المختبر والعمل في خزانة كيميائية. نضيف جزءا واحدا من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30٪ ، ثم ثلاثة أجزاء من حمض الكبريتيك المركز ليؤدي إلى تفاعل شديد ومؤكسد حامض الكبريتيك الأحادي.

يتفاعل هذا الخليط بعنف مع المواد العضوية ، بما في ذلك تلك الموجودة في بشرتك وعينيك وملابسك. يسخن على الفور. احتضن الشرائح لمدة 30 دقيقة.

أمسك زلة الغطاء بالقوة اغسل الحمض جيدا على جانبي زلة الغطاء النظيف باستخدام الماء المقطر أو عالي الجودة المتحد. ثم ضع الشريحة على حامل تفلون واتركها تجف لمدة لا تزيد عن 10 دقائق لتتمكن من إنتاج العديد من الطبقات الدهنية الفردية في وقت واحد. نحن الغراء زلات الغطاء المجفف مع تصلب سريع.

غراء إيبوكسي مكون من مكونين إما لغرفة تكنولوجيا مختبر ثمانية أو 16 بئر. أولا ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية الأصلية بعناية من إطارها. امزج مكوني الغراء بنسبة واحد إلى واحد.

انشرها بالتساوي في الأخاديد السفلية لإطار الغرفة. ضع زلة الغطاء النظيفة على الجزء السفلي المغطى بالغراء من إطار الغرفة. تأكد من انتشار الغراء بالتساوي بين الشريحة الزجاجية والإطار البلاستيكي.

دع الغراء يتماسك لمدة 30 دقيقة. قم بتخفيف المعلق المادي الدهني في PBS من واحد إلى 10 وقم بتصفيته من خلال مرشح 0.2 ميكرون عند 120 ميكرولتر من هذا التخفيف إلى كل بئر من ثمانية غرف آبار أو 60 ميكرولترا لكل بئر من غرفة بئر 16. تأكد من تغطية السطح الزجاجي بالكامل وانتظر لمدة 20 دقيقة.

تم تشكيل الطبقة الثنائية الآن للتخلص من المتبقية لشطف كل بئر مع 30 مل من PBS. تجنب التعرض للهواء للسطح الزجاجي بأي ثمن. سيؤدي ذلك إلى تدمير الطبقة الثنائية على الفور للتأكد من أن كل بئر يحتوي على نفس حجم المخزن المؤقت بالنسبة لخطوة زخرفة البروتين التالية ، املأ كل بئر تماما وقم بإزالة القبة السائلة.

أخرج 330 ميكرولتر. سيترك هذا حوالي 350 ميكرولتر داخل كل منها. حسنا لتزيين الطبقة الثنائية بالبروتينات ، قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على بروتينات تقنية بولي الهيستامين المفضلة وأضف 50 ميكرولترا منه إلى كل بئر.

ترتبط البروتينات بمجموعة النيكل المضادة للرأس من الدهون الداكنة لضمان نتائج قابلة للتكرار مختلطة جيدا ولكن بعناية ودائما لمدة 60 دقيقة لإزالة البروتينات غير المرتبطة. يغسل مرة أخرى مع 30 مل من PBS. دعونا نركز الآن على أجهزة الفحص المجهري.

أولا ، سنوضح متطلبات الفحص المجهري الانعكاس الداخلي الكلي للفحص المجهري للعشب القائم على الموضوع. يحتاج المرء إلى هدف غمر الزيت بفتحة عددية عالية. ينعكس شعاع إثارة الليزر الوارد بواسطة المرآة ثنائية اللون ويتم تركيزه عبر مجموعة من عدستين أو ثلاث على المستوى البؤري الخلفي للهدف فقط.

ثم يقود ضوء الليزر الهدف كشعاع مغلف على طول المحور البصري. بهذه الطريقة ، تضيء عينة الفلورسنت بعمقها الكامل. عندما تقوم بنقل الحزمة بشكل عمودي على المحور البصري ، يظل الشعاع مجمعا ، لكنه يترك الهدف بطريقة مائلة.

إذا واصلت الانتقال ، فستصل في مرحلة ما إلى الزاوية الحرجة التي ينعكس عندها الشعاع تماما عند الواجهة بين زلة الغطاء الزجاجي والعينة. تتحلل شدة الموجة الزائلة الناتجة بشكل كبير وتتحمس الطوابق الأربعة فقط ، والتي تقع بالقرب من الواجهة حتى عدة مئات من النانومترات. الآن ، نوضح كيفية تركيز شعاع الليزر يدويا في المستوى البؤري الخلفي للهدف.

باستخدام ثلاث أو عدسات مع العدستين الأوليين ، يتم زيادة قطر شعاع الليزر. تحدد نسبة البعد البؤري حجم بقعة الإضاءة في مستوى العينة. لضمان بقاء الحزمة مجمعة، اضبط المسافة بين هذه العدسات بحيث تساوي مجموع كلا البعدين البؤريين.

تستخدم العدسة الثالثة لتركيز الحزمة الموسعة في المستوى البؤري الخلفي للهدف. نظرا لأن البعد البؤري لهذه العدسة يحتاج إلى استيعاب أبعاد جسم المجهر وأبعاد المنظار المرتبط به ، يجب أن يكون أطول بكثير في حالتنا ، 75 سم مختلفة. المسافة بين العدسة الثانية والثالثة ليس لها أي تأثير على خصائص الحزمة.

لذلك ، يمكن استخدام المساحة اللانهائية بينهما لتعديل الحزمة بطريقة محددة دون تشوهات. على سبيل المثال ، يمكنك إدخال فتحة وإسقاطها بدقة على مستوى العينة. في الأساس ، يمكنك تحقيق الشيء نفسه باستخدام عدستين بدلا من ثلاثة.

نظام العدستين أقل تحديدا ولكنه يقدم انحرافات أقل للعدسة. ميزات بسيطة مثل فتحة العدسة لا يزال من الممكن تنفيذها بشكل جيد للغاية للتعديل الزمني. يجب وضع ليزر الغاز أو الحديد أو الحالة الصلبة أمام مصراع نطاق المللي ثانية ، على سبيل المثال ، مصراع ميكانيكي أو معدل بصري.

البديل الجيد هو ليزر الصمام الثنائي ، والذي يمكن تعديله إلكترونيا ولا يحتاج إلى إغلاق خارجي. مرآتان تكفيان لاستهداف الشعاع إلى أي مكان وفي أي اتجاه. كما نوقش من قبل ، يتم استخدام العدستين لتوسيع الحزمة وتركيزها على المستوى البؤري الخلفي للمجهر. هدف.

يمكننا نقل الشعاع لتكوين العشب عن طريق تحويل المرآة السفلية للمنظار على سكة بصرية. لاكتشاف الصور ، نستخدم كاميرا شديدة الحساسية. على سبيل المثال ، يمكن محاذاة جهاز مقترن بالشحنة المضاعفة للإلكترون أو شعاع ليزر ثان em CCDA بطول موجي مختلف في مسار الحزمة.

مع استخدام المرايا وتراكب ثنائي اللون. للكشف عن لونين متزامنين ، نضع جهاز تقسيم الشعاع المتاح تجاريا في مسار الانبعاث. بالنسبة للتجارب ، من المفيد جدا أن يكون لديك مساران مستقلان لشعاع الإثارة في مكانهما.

على سبيل المثال ، واحد لتصوير العشب والثاني للتبييض الضوئي المستهدف أو التنشيط. يمكن تحقيق ذلك بسهولة من خلال تنفيذ مجموعة من 2 50 50 مقسمات شعاع. كما هو موضح في الرسم التوضيحي الخاص بنا ، سيؤدي نظامان مختلفان لضبط العدسة والمرآة إلى ظهور ملفين فرديين للشعاع وزوايا شعاع.

على سبيل المثال ، واحدة موسعة للتصوير في العشب وواحدة أكثر تركيزا للتبييض أو التنشيط في غير العشب. يمكن وضع فتحة في العارضة غير العشبية لتشكيل بقعة التبييض أو التنشيط بدقة. مصراعان إضافيان ، واحد لكل مسار شعاع قم بتمكين مفتاح التحكم المستقل على شعاع الليزر ، مما يترك الهدف في مسار مستقيم غير مائل.

قم بتشغيل عداد الطاقة واضبطه على الطول الموجي لليزر المقابل. قم بقياس قوة ضوء الليزر عند الهدف واكتبه. الآن ، قم بنقل المرآة خلف المجهر لإمالة شعاع الليزر عند الهدف إلى وضع العشب.

لا تنظر مباشرة إلى ضوء الليزر. في الزاوية اليمنى السفلية ، ترى ملف تعريف شدة ليزر الإثارة كما هو موضح من خلال انبعاث طبقة ثنائية مزينة ببروتينات الفلورسنت. هنا نستخدم تمثيلا للون الزائف لتسليط الضوء على المناطق ذات الشدة المختلفة.

قم بقياس متوسط كثافة الخلفية داخل منطقة اهتمام كبيرة بما يكفي. تعتمد هذه القيمة على إعدادات محددة للكاميرا مثل كسب EM وسرعة القراءة ويجب طرحها من جميع الشدة المقاسة. حدد متوسط الشدة داخل المنطقة المضيئة بأكملها.

اختر القطر الكبير بما يكفي بحيث تكون قيم الشدة في المحيط مماثلة لقيم خلفية الكاميرا لقياس متوسط كثافة المنطقة المركزية. يحدد هذا المجال منطقة الاهتمام التي سيتم فيها إجراء تجارب الفحص المجهري لاحقا. الآن ، اطرح متوسط قيمة شدة الخلفية من شدة كل من المنطقة التي تم التخلص منها والمنطقة المركزية.

بعد ذلك ، اضرب شدة الخلفية المصححة برقم البكسل المقابل لحجم المنطقة للوصول إلى شدة متكاملة. اضبط الكثافة المتكاملة للمنطقة المضيئة كواحد واحسب الكسر للمنطقة المركزية. الطاقة المقاسة بعداد الطاقة.

في حالتنا ، يتناسب خمسة مللي واط طرديا مع الكثافة المتكاملة للمنطقة المضيئة بأكملها. اضرب هذه القيمة في جزء القدرة من المنطقة المركزية لتحديد القدرة داخل المنطقة المركزية. في مثالنا ، 1.15 مللي واط ، يعتمد عامل تحويل عدد وحدات البكسل إلى ميكرون مربع على حجم البكسل الفعلي لشريحة الكاميرا وتكبير مسار الانبعاث.

يمكن تحديده بسهولة باستخدام شريحة ميكرومتر. في مثالنا ، تتوافق المنطقة المركزية مع 170.8 ميكرون مربع. تشير كثافة الطاقة إلى الطاقة المقاسة مقسومة على المساحة وبالتالي تساوي 1.15 مللي واط مقسومة على 170.8 ميكرون مربع أو 0.007 مللي واط لكل ميكرون مربع.

أي 0.7 كيلوواط لكل سنتيمتر مربع. لتحديد سيولة الطبقة الثنائية ، نقوم بإجراء استرداد مضان بعد التبييض الضوئي لتجربة التفاف. كما هو موضح في الفيلم السفلي الأيسر ، نصور الطبقة الثنائية الفلورية بكثافة طاقة منخفضة.

في الفيلم السفلي الأيمن ، يمكنك رؤية غرفة تقنية المختبر المقابلة على المجهر. ثم نقوم بتبييض منطقة دائرية بنبضات قصيرة عالية الكثافة للطاقة ونراقب الانتعاش بكثافة طاقة منخفضة. مرة أخرى ، يقدم المونتاج نظرة عامة على التجربة لنقاط زمنية مختلفة مع عدم وجود وقت هو نبضات التبييض.

نقوم بقياس متوسط شدة التألق المصحح للخلفية داخل دائرة العلامة وتطبيع جميع الشدة المقاسة إلى الشدة في بداية التجربة. قبل نبضات التبييض ، نرسم قيم الشدة الطبيعية مع مرور الوقت. تمثل قيمة التشبع الكسر المحمول في حالتنا أكثر من 90٪ أولا ، التقط صورة للطبقة الثنائية بكثافة طاقة إثارة منخفضة.

على سبيل المثال ، من خلال وضع مرشح كثافة ضوئية بقيمة توهين لوغاريتمي تبلغ اثنين ، فإن هذا يقلل من الطاقة بمعامل 100. يجب أن يكون وقت التعرض ثابتا طوال الإجراء بأكمله وكافيا لتصوير قوة سائل واحدة عند كثافة القدرة غير المخففة في حالتنا ، 10 مللي ثانية عند 0.7 كيلوواط لكل سنتيمتر مربع. استخدم تمثيل الألوان الزائف لتسليط الضوء على المناطق ذات الشدة المختلفة.

اختر منطقة واحدة ذات أهمية يتم فيها إجراء قياسات الجزيء الفردي لاحقا ومنطقة واحدة من نفس الحجم. لطرح الخلفية ، احسب الكثافة المتكاملة المطروحة في الخلفية. الآن قم بإزالة مرشح الكثافة الضوئية من مسار شعاع الإثارة ، وتبييض المنطقة والتقط صورة.

سترى قوة الإنفلونزا الفردية تنتشر في المنطقة المبيضة. قوة الإنفلونزا المفردة محدودة الحيود بقطر نموذجي من اثنين إلى ثلاثة بكسل ، خذ منطقة واحدة من سبعة في سبعة بكسل حول كل إشارة جزيء واحد والمنطقة الثانية القريبة. لطرح الخلفية ، من المهم تحديد إشارة قوة الفلور المفردة فقط.

لذلك ، من الأفضل تصوير البروتينات على طبقة BI بنسبة إلى بروتين أقل من واحد أو للبروتينات المصنفة على وجه التحديد SAT. حتى أكثر من نسبة النظام الغذائي إلى البروتين من واحد كما هو موضح في مثالنا ، قم بقياس الشدة المتكاملة لكلتا المنطقتين واطرح الخلفية من الإشارة حتى لا تأخذ آخر حدث ملحوظ موضح في مثالنا حيث من المحتمل أن يكون التبييض قد حدث أثناء متوسط التعرض. الإشارات المصححة هنا ، نقوم بذلك لإنفلونزا واحدة من أربعة ، والتي نلاحظها على تسعة إطارات.

ومع ذلك ، يجب تنفيذ هذا الإجراء لما لا يقل عن عدة مئات من أحداث الجزيء الفردي. دعنا نعود إلى صورتنا الأصلية ثنائية الطبقة التي لوحظت عند كثافة قوة الإثارة المخففة. يتم تحديد الكثافة الجزيئية عن طريق تصحيح الكثافة المتكاملة للمنطقة ذات الأهمية لكثافة طاقة الإثارة المنخفضة من خلال الضرب في مائة وقسمتها على متوسط شدة الجزيء الفردي والمساحة.

نحن نتعامل مع كثافة 421.4 قوة فلور لكل ميكرون مربع. في مثالنا ، مع نسبة النظام الغذائي إلى البروتين التي تبلغ واحدا ، هذا يساوي نفس عدد الجزيئات لكل ميكرون مربع. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إعداد وتوصيف طبقة ثنائية دهنية وظيفية بالبروتين باستخدام الفحص المجهري الفلوري أحادي الجزيء.

علاوة على ذلك ، يجب أن تكون على دراية بالمبادئ الأساسية لتعديل وترقية المجهر القياسي لهذا الغرض. سنستخدم هذه المنهجية لاحقا لتحديد حركية ربط المستضد المرتبط ثنائي الطبقة بمستقبلات الخلايا التائية المرتبطة بالخلايا ، ولكن العديد من التطبيقات الأخرى بناء على ذلك ممكنة بالتأكيد.