الإنتاجية العالية فحص الاختلافات الإستعصاء في Lignocellulosic الكتلة الحيوية: إجمالي اللجنين، اللجنين مونمرات، والأنزيمية السكر الإصدار

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس مدى مقاومة المواد الخام الحيوية المتنوعة والمنتسبة لبعضها البعض للمعالجة الكيميائية الحرارية والتحلل الإنزيمي. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير عينات الكتلة الحيوية للاختبار عن طريق تقليل الحجم واستخلاص النشا والسكريات القابلة للذوبان. وتتمثل الخطوة الثانية في توزيع الكتلة الحيوية بدقة عالية في ألواح مفاعلات عالية الإنتاجية ومتوافقة كيميائياً حرارياً.

تتم معالجة العينات مسبقاً في مفاعل بخاري. بعد ذلك، تُهضم العينات باستخدام إنزيم السيلولاز التجاري القياسي لمدة ثلاثة أيام لتحليل السيلولوز والهيميسيلولوز. الخطوة النهائية هي تقدير كمية الجلوكوز والكسيلوز المتحررة أثناء التحلل الإنزيمي باستخدام مقاييس GO pod وXDH.

وفي النهاية، يُستخدم التحديد الكمي عالي الإنتاجية للجلوكوز والكسيلوز لتحديد مقدار إطلاق السكر النسبي بين العينات بناءً على جرام من السكر لكل جرام من الكتلة الحيوية الأولية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى المطبقة على نطاق مخبري، مثل المعالجة المسبقة والتحلل الإنزيمي على نطاق مخبري، في إمكانية تطبيق هذه التقنية على مئات أو حتى آلاف العينات في آن واحد. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال تحويل الكتلة الحيوية، مثل تحديد أي الأصناف أو السلالات تكون أكثر قابلية للتحويل إلى سكريات ومن ثم إلى منتجات لاحقة.

وبالتالي، يمكن توسيع تطبيقات هذه التقنية نحو فهم بنية وجدار الخلية ووظيفتهما، لأن الطفرات التي نستحدثها في مسار التخليق الحيوي لجدار الخلية يمكن فحصها للكشف عن التغيرات الكيميائية البنيوية. ومن ثم، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول المواد المقاومة في جدار الخلية النباتية. كما يمكن تطبيقها على مكونات أخرى من تحويل الكتلة الحيوية، مثل دراسات نشاط الإنزيمات والتآزر الإنزيمي.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في تنفيذها لأنها تتضمن مجموعات كبيرة من عينات بدائل الكتلة الحيوية التي يجب التعامل معها بشكل متماثل ومتزامن على مقياس المليجرام؛ لذا فهي تتطلب روبوتات ومعدات متخصصة. لبدء الإجراء، يتم نقل ما يقرب من 250 milligrams من الكتلة الحيوية المطحونة مسبقاً من كيس مضاد للكهرباء الساكنة ومزود برمز شريطي إلى كيس شاي مرقم، ثم يُلف كيس الشاي بعناية مع التأكد من طي النهايات فوق الكتلة الحيوية لمنع الفقد أثناء عمليات إزالة النشا والاستخلاص. بعد ذلك، يتم إغلاق كل كيس شاي بإحكام باستخدام سلك نحاسي مطلي بالقصدير، مع تسجيل رقم كيس الشاي لكل عينة ذات رمز شريطي.

أضف 500 milliliters من محلول إنزيم إزالة النشا المُحضّر مسبقاً إلى حاوية بلاستيكية. ثم أضف 120 كيساً من الشاي إلى محلول الإنزيم المنظم وفقاً لبروتوكول المعالجة بالدفعات. وبعد التحضين في هزاز، اشطف الكتلة الحيوية وانقعها في عدة لترات من الماء منزوع الأيونات لمدة 30 دقيقة بعد إجراء شطف شامل للكتلة الحيوية منزوعة النشا.

لإزالة أملاح المنظم، ضع أكياس الشاي في عمود استخلاص مبطن بالجوارب. قم بضبط نظام الارتجاع المبطن بالجوارب باستخدام ethanol بتركيز 95%، واستخلص العينات لمدة 24 ساعة. بمجرد اكتمال عملية الاستخلاص، قم بفك أكياس الشاي وأعد الكتلة الحيوية المجففة إلى الأنابيب الأصلية ذات الرموز الشريطية.

أكياس مضادة للاستاتيكية انقل ما لا يقل عن 50 milligrams من الكتلة الحيوية المجففة إلى قمع مزود برمز شريطي. امسح الرموز الشريطية للأكياس المضادة للاستاتيكية والقمع المستقبل لضمان تتبع دقيق للعينة. بعد تحميل الأقماع على روبوت وزن صلب، قم بوزن خمس milligrams من العينات المجففة آلياً في أوعية من الفولاذ المقاوم للصدأ والمقاوم للأحماض.

في أطباق ذات 96 بئراً، يتم وزن ثلاث مكررات من كل عينة وتوزيعها في أنحاء الطبق لتقليل أي تباينات موضعية. بعد ذلك، يتم إضافة 250 µL من الماء منزوع الأيونات إلى كل بئر، ثم تُغلق الأطباق باستخدام شريط POLYTETRAFLUOROETHYLENE أو PTFE المدعم بلاصق السيليكون. وباستخدام رأس مكواة لحام بمقاس 1/8 بوصة، يتم ثقب شريط PTFE عند كل منفذ بخار.

لكل لوح، يتم تثبيت الألواح بإحكام باستخدام حشوات PTFE معززة بالزجاج بسمك 0.031 بوصة بين الألواح، مع وضع ألواح فارغة في أعلى وأسفل المجموعة. يتم إجراء معالجة أولية للعينات باستخدام مفاعل بخاري مضبوط على 180 درجة Celsius لمدة 17.5 دقيقة. عند الانتهاء، يتم تبريد ألواح المفاعل إلى 50 درجة Celsius عن طريق الغمر بالماء منزوع الأيونات.

عندما تبرد الأطباق، قم بطردها مركزياً باستخدام جهاز طرد مركزي ذو سلال متأرجحة. اضبط الدوار على 1700 GS لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة الغشاء العلوي.

أضف 40 µL من محلول الإنزيم المخزني بتركيز 8% الذي تم تحضيره مسبقاً إلى كل بئر، وبعد إعادة الإغلاق باستخدام شريط PTFE جديد، ضع الطبق المختوم في مشبك أطباق مغناطيسي. امزج العينات بلطف عن طريق القلب 15 مرة على الأقل، ثم قم بالتحضين عند 50 °C لمدة 70 ساعة. بعد التحضين، يتم خلط أطباق المفاعل وطردها مركزياً.

بعد ذلك، يُستخدم روبوت مناولة السوائل لإجراء تقدير كمي للجلوكوز والكسيلوز من خلال مقاييس لونية مرتبطة بالإنزيمات؛ حيث يُستخدم إنزيم ديهايدروجيناز الكسيلوز، أو XDH، لتقدير الكسيلوز، وإنزيم أكسيداز الجلوكوز والبيروكسيديز، أو go pod، لتقدير الجلوكوز. يتم تجهيز منصة الروبوت بخزانات تحتوي على كاشف GO POD وكاشف XDH، بالإضافة إلى الماء للتخفيف، ورفوف رؤوس ماصات ذات 96 قناة بسعة 200 µL لكل كاشف. وتُستخدم هذه الرؤوس بشكل متكرر لعدة ألواح تفاعل.

يحتوي السطح أيضاً على رؤوس ماصات أحادية الاستخدام سعة 200 ميكرولتر لإزالة الماء وإعداد معايير السكر، بالإضافة إلى معايير سكر جاهزة. يقوم الروبوت بجلب ثلاثة أطباق معايرة دقيقة شفافة من قوارير HPLC الموجودة في قرص التخزين، أحدها لتحضير تخفيف خليط التحلل المائي، وواحد لكل من مقايستي XDH وGoPod. يقوم القابض بنقل الأطباق الأربعة جميعاً إلى مواقعها على السطح.

يتم جلب رؤوس ماصات (tips) ذات استخدام واحد، بسعة 100 microliter وعدد 96 قناة، من القرص الدوار إلى سطح الجهاز لاستخدامها في النقل من المفاعل إلى لوحة التخفيف، ومن لوحة التخفيف إلى لوحات XDH و go pod. وباستخدام الماصة ذات الثماني قنوات وقابلية الضبط (variable span)، يتم إزالة الماء الذي أضيف قبل المعالجة الأولية من الآبار الثلاثة الموجودة في كل زاوية من لوحة المفاعل لمنع الانتقال العرضي إلى لوحة التخفيف. وذلك لأن هذه الآبار الاثني عشر تُستخدم لمعايير السكر باستخدام رأس الماصة ذي الـ 96 قناة.

بعد إزالة الرؤوس الثلاثة الموجودة في كل زاوية، يتم إضافة 180 µL من الماء إلى آبار لوحة التخفيف. وبعد تغيير الرؤوس، تُنقل كواشف XD وH وgo pod من خزاناتها الخاصة إلى لوحات المقايسة الخاصة بها، وذلك باستخدام رأس الماصة ذو 96 قناة.

بينما يحدث ذلك، تُضاف معايير السكر إلى الآبار الثلاثة في كل ركن من أركان لوحة التخفيف. وباستخدام رأس الماصة ثماني القنوات، وبعد التغيير إلى رؤوس أصغر، يُستخدم رأس الماصة ذو الـ 96 قناة لنقل 20 µL من طافي التحلل المائي إلى لوحة التخفيف، ثم تُمزج اللوحة عن طريق الرج. يجب سحب العينة من بالقرب من الجزء العلوي من السائل للحد من تلوث الرؤوس بجزيئات الكتلة الحيوية.

بعد الخلط، يتم نقل 20 µL بالتتابع. باستخدام رأس الماصة ذو 96 قناة إلى ألواح XDH وgo pod. ومع خلط كل منها بواسطة trier، تُعاد رؤوس الماصة المستخدمة في العينات وألواح التفاعل والتخفيف إلى حامل النفايات في الكاروسيل، ثم تُنقل ألواح XDH وgo pod إلى حامل كاروسيل منفصل وتُترك لمدة ساعة واحدة قبل القراءة في جهاز قياس الطيف الضوئي، باستخدام قارئ ألواح 96 بئراً للأشعة فوق البنفسجية والمرئية.

اضبط الطول الموجي للقياس على 510 نانومتر وسجل الامتصاصية مقابل محلول كاشف فارغ. بعد ذلك، اضبط الطول الموجي للقياس في قارئ الأطباق على 340 نانومتر وسجل الامتصاصية باستخدام ملعقة صغيرة. وزع حوالي 4 مليجرام من الكتلة الحيوية المحضرة في كوب من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة 80 ميكرولتر مصمم لجهاز أخذ العينات التلقائي في مطياف الكتلة.

باستخدام ثقابة قياسية، قم بإنتاج أقراص ترشيح زجاجية يدويًا من صفائح الألياف الزجاجية من النوع ad بدون مادة رابطة، ثم قم بتحميل العينات في رفوف جهاز السحب التلقائي باستخدام ملاقط، مع تحميل العينات في الكؤوس بشكل عشوائي لتجنب الانحياز الناتج عن انزياح المطياف بمرور الوقت. بعد إجراء المعايرة وإدخال المعاملات المناسبة في مطياف الكتلة، ابدأ في اكتساب البيانات وانتظر لمدة 60 ثانية على الأقل للحصول على بيانات كافية لجمع أطياف الخلفية. وأخيرًا، ابدأ طريقة السحب التلقائي الآلية باستخدام معدل تدفق لغاز الهيليوم الحامل يبلغ 0.9 liters per minute.

من الأمثلة على الاتجاهات مسح للمواد المقاومة لـ 755 نوعاً طبيعياً من الحور تم أخذ عينات منها في شمال غرب المحيط الهادئ. وتشير النتائج إلى أنه كلما ارتفعت نسبة السرنجة إلى غيل، انخفضت المقاومة حتى تصل النسبة إلى حوالي اثنين، حيث يستقر مستوى تحسن المقاومة. ويمكن رؤية القيم الشاذة هنا حيث تم تثبيط تعبير جين PT four CL one.

في أشجار الحور، تبين أن العديد من الأصناف المائة التي خضعت للفحص قد زادت بوضوح في المواد المقاومة للتحلل، كما يتضح من انخفاض إطلاق السكريات. وقد أدى استخدام أصناف مختلفة من قش القمح المزروعة في عدة مواقع والمحصودة بعد تغييرات متنوعة في ظروف النمو إلى تكوين 20 مجتمعاً متميزاً بناءً على مجموعات المتغيرات المذكورة أعلاه. وتتميز مجموعات العينات هذه بسهولة التمييز بينها، وهي تشير إلى متغيرات إيجابية وسلبية.

بالنسبة للتحلل الحراري للمواد المستعصية، يمكن استخدام مطيافية الكتلة بالحزمة الجزيئية لتقييم التغيرات في تركيب الجدار الخلوي. يتم تعيين شظايا طيف الكتلة لمونومرات اللجنين المختلفة. وعند مقارنة عينة ذات محتوى عالٍ من اللجنين مقابل عينة ذات محتوى عالٍ من الكربوهيدرات، تكون التباينات في البيانات الطيفية واضحة.

يتم هنا توضيح استخدام بيانات مطيافية الكتلة، مقترنة بتحليل المكونات الرئيسية. يمكن لمخطط تحميلات المكونات الرئيسية أن يساعد في تحديد السمات الكيميائية التي يتم تفسيرها في مخطط تصنيف الدرجات، بالإضافة إلى توضيح السمات التي تتغير بين مجموعات العينات. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن استخدامها لفحص آلاف العينات أسبوعياً إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم توخي أقصى قدر ممكن من الاتساق ومقارنة العينات فقط ضمن مجموعة ذات صلة.

بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق لباحثين آخرين للعمل على طرق الفحص عالية الإنتاجية ومجالات أخرى تتعلق باستعصاء جدار الخلية النباتية، باستخدام مواد مثل السوائل الأيونية والمعالجة المسبقة القلوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير ومناولة وتحليل مجموعات عينات كبيرة من الكتلة الحيوية بشكل صحيح على المقياس الميكروي للكشف عن الاختلافات في الاستعصاء باستخدام تقليل الحجم والاستخلاص، والمعالجة الكيميائية الحرارية المسبقة والتحلل الإنزيمي. يرجى تذكر أن العمل تحت ضغط عالٍ وبخار ومعدات مؤتمتة ينطوي على مخاطر شديدة، ويجب اتخاذ جميع احتياطات السلامة، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية، بالإضافة إلى التأكد من وجود أقفال أمان في جميع المعدات أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.