تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS

الهدف العام لبروتوكول قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF هو تحسين كتابة مسببات الأمراض النادرة من خلال إجراء سريع وفعال من حيث التكلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة التشخيصي ، فهي تسمح بالتنوير السريع لمسببات الأمراض البكتيرية النادرة. اليوم ، نريد أن نتحدث عن العطر والبكتيريا من جنس Myroides.

لتوضيح الطريقة والتحدث عن تفسير النتائج. بشكل عام ، قد يجد الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن نقل البكتيريا ، والتراكب مع المقاييس ، وتفسير النتائج يتطلب مهارات فنية وخبرة ميكروبيولوجية. خطرت لنا فكرة استخدام MALD-TOF MS للكشف عن البكتيريا النادرة عندما كان لدينا مريض في مستشفانا يعاني من عدوى غذائية السكرية ناجمة عن myroides odoratimus.

ابدأ هذا البروتوكول باستخراج الحمض النووي البكتيري ، و 16S DNA الريبوزومي PCR وتسلسل Sanger كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم عود أسنان خشبي لنقل مستعمرة بكتيرية واحدة إلى بئر من 96 بئر فولاذية. ضع ميكرولتر واحد من حمض الفورميك بنسبة 70٪ فوق الكائن المجفف بالهواء على الهدف الفولاذي ، واتركه ليجف لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق تقريبا.

قم بتراكب البقعة بميكرولتر واحد من محلول المصفوفة الذي يحتوي على 50 مجم / مل من CHCA في مذيب عضوي يتكون من 50٪ أسيتونيتريل و 2.5 حمض ثلاثي فلورو أسيتيك و 47.5٪ ماء. دع اللطاخة والمصفوفة المتراكبة تجف في الهواء لمدة خمس دقائق في الغطاء. لإدخال العينات ، قم بتهوية منفذ تحميل العينة لمطياف الكتلة بالضغط على زر الإدخال / الخارج الخاص بالجهاز.

افتح منفذ التحميل وأدخل اللوحة المستهدفة MALDI-TOF MS مع مصفوفة اللطاخة البكتيرية المجففة. أغلق الميناء وقم بالإخلاء مرة أخرى. راقب الفراغ وعندما يصل إلى 4.5 مليون مليبار ابدأ القياس.

افتح برنامج تحليل MMIS وانقر فوق قائمة الملف. حدد تصنيف جديد"، يجب فتح نافذة جديدة تسمى معالج تصنيف الوقت الحقيقي MALDI Biotyper. اكتب اسم المشروع في الحقل اسم المشروع "وانقر فوق جديد" ، ضمن مربع الحوار الجديد المسمى مشروع جديد ، تحقق من اسم المشروع وتابع بالنقر فوق الزر "موافق".

في معالج تصنيف الوقت الحقيقي MALDI Biotyper ، لاحظ نافذة موضع Analyte. حدد المواضع المستهدفة، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق أي موضع محدد، وحدد إضافة عينات. في طريقة عرض الجدول المفتوحة تلقائيا، اكتب اسم العينة ومعرف العينة وتعليقا اختياريا.

انقر فوق الزر "التالي" للمتابعة. بعد ذلك ، لاحظ تحديد نافذة طرق MALDI Biotyper. حدد Bruker Taxonomy" من MSPs من أشجار التصنيف وانقر فوق التالي" للمتابعة.

ثم راقب نافذة ملخص المشروع. تحقق من الإدخالات المدرجة أعلاه لمشروع التصنيف الفعلي. ابدأ تشغيل التصنيف بالنقر فوق الزر "إنهاء".

تبدأ القياسات تلقائيا عند الوصول إلى الفراغ المناسب. اتبع تشغيل التصنيف حتى يكتمل القياس بنجاح. بمجرد اكتمال القياس ، افتح القائمة عرض "وانقر فوق النتائج" لعرض جدول النتائج في مشروع تصنيف MALDI Biotyper في الوقت الفعلي الأول.

اعرض نتائج تصنيف Bruker-Daltonik MALDI Biotyper كملف html في متصفح الويب الافتراضي. اطبع النتائج واحفظها. تظهر هنا أطياف تم الحصول عليها بواسطة MALDI-TOF MS والتي يتم قياسها وتصنيفها في الوقت الفعلي.

يتم تعيين اسم نوع للأطياف وقيمة درجة تعكس جودة القياس. تمثل الدرجات التي تزيد عن 2.300 تحديدا محتملا للغاية للأنواع. تشير الدرجة بين 2.000 و 2.300 إلى تحديد آمن للأنواع.

تشير الدرجة التي تقل عن 1.700 و 2.000 إلى تحديد الأنواع المحتملة. والنتيجة التي تقل عن 1.700 غير موثوقة. يستغرق تحديد مسببات الأمراض البكتيرية المزروعة في ثقافة نقية على وسط صلب من دقيقتين إلى ثلاث دقائق.

من المهم أن تتذكر أنه لا يمكن العثور على مسببات الأمراض البكتيرية النادرة إلا باستخدام MALDI-TOF MS عندما تحتوي الأدوات بشكل موثوق على الأطياف المناسبة. خلاف ذلك ، يجب محوه عن طريق دمج أطياف MaSDA من السلالات المكتوبة من عزلاتها المميزة. في حالة عدم ظهور نتائج النتيجة إلى تحديد سلالة لا لبس فيها ، يمكن تطبيق طرق أخرى ، مثل التنميط الكيميائي الحيوي أو تسلسل 16S rDNA.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للكشف عن البكتيريا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية الدقيقة الأخرى مثل الفطريات أو اللاهوائية. علاوة على ذلك ، يمكن قياس مقاومة البكتيريا. لا تنس العمل مع مصفوفة وهي مادة خطرة ، وارتداء القفازات والنظارات الواقية ، والعمل تحت غطاء المحرك.

علاوة على ذلك ، من الضروري للغاية تجفيف المصفوفة وتشويهها جيدا لتجنب تناثر الطعام في غرفة التحليل.