في المختبر جيل من الخلايا الجذعية من الفئران بلازماوية الشكل المشتركة اللمفاوية الأسلاف باستخدام نظام تغذية AC-6

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة فعالة لتوليد الخلايا التغصنية البلازمية أو PDCs لدراسة تطورها. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة، مثل كيف يتم تنظيم تطور PDCs؟ الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باستخدام عدد صغير من الخلايا السلفية لتوليد كميات كبيرة من PDCs بكفاءة.

تكمن تداعيات هذه التقنية في علاج الأمراض المناعية الذاتية المرتبطة بالـ PDC مثل الذئبة الجهازية، والربط، والصدفية. إن استعراض هذا الإجراء اليوم سيكون بمثابة إضافة كبيرة لطلاب المختبر. في اليوم السابق لحصاد خلايا نخاع العظم، يتم استزراع خلايا الخط الخلوي السدوية AC six بكثافة 5.9 × 10⁴ خلية لكل بئر في آبار فردية من أطباق ذات 12 بئراً، ثم تُحضن الأطباق عند 37 °C و5% carbon dioxide طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، يتم تعريض خلايا AC six للإشعاع غاما بجرعة 3000 rad واستبدال وسط الزرع بـ 1 mL من الوسط الكامل.

بعد ذلك، ضع العدد المناسب من فئران C 57 black six البالغة من النوع البري في صينية تشريح وقم بتعقيم الحيوانات باستخدام ethanol 70%. ثم انقل الصينية إلى غطاء تدفق هوائي شبه معقم، وقم بعمل شقوق في منتصف بطن كل حيوان، مع إزالة الجلد من الأجزاء الطرفية، بما في ذلك الأطراف السفلية لتحرير عظام الفخذ والساق؛ ثم قم بقص عظمة الفخذ فوق مفاصل الركبة وعظام الساق تحتها، واستخدم المقص لفصل العضلات عن العظام أثناء جمعها. ضع العظام في طبق Petri سعة 6 cm يحتوي على 5 mL من RPMI الكامل، ثم انقل طبق Petri إلى غطاء زراعة معقم.

الآن، املأ محقنة سعة 3 mL مجهزة بإبرة قياس 27 gauge بوسط RPMI الكامل، واستخدم مقصاً لقص كلا الطرفين من كل عظمة. أدخل الإبرة في كل عظمة واغسل النخاع عن طريق حقن وسط RPMI الكامل بلطف مرة واحدة من كل طرف. بعد ذلك، وبدون الإبرة، قم بشفط الخلايا وتفريغها بلطف من ثلاث إلى خمس مرات في طبق الزرع للحصول على معلق خلوي مفرد.

بعد تدوير الخلايا بالطرد المركزي لترسيبها، يتم تحلل خلايا الدم الحمراء باستخدام 1 ml من منظم CK، ثم يتم إيقاف التفاعل بإضافة 10 أضعاف الحجم من وسط RPMI الكامل. وبعد مرور دقيقة واحدة، تُترك تجمعات الخلايا الميتة والحطام الخلوي لتترسب لمدة خمس دقائق، ثم يُصب السائل الطافي بعناية في أنبوب جديد. بعد ذلك، وبعد تدوير الخلايا مرة أخرى، يتم تعليق إجمالي خلايا نخاع العظم في 100 µl من منظم fax لتحليل السلف اللمفاوي المشترك (CLPs) بواسطة قياس التدفق الخلوي.

بعد ذلك، قم بحجب مستقبلات FC في الخلايا باستخدام anti CD 16 to 32 لمدة دقيقة إلى دقيقتين، يليه صبغ الخلايا في آن واحد باستخدام مزيج الأجسام المضادة المناسب. بعد 15 minutes على الثلج، اغسل الخلايا في 3 milliliters من fax buffer وأعد تعليق الراسب في 300 microliters من fax buffer طازج. ثم قم بترشيح معلق الخلايا عبر مصفاة بمسامية 40 micrometer وقم بفرز الخلايا فوراً باستخدام مقياس التدفق الخلوي (flow cytometer) مع استخدام المرشحات والجهود الكهربائية المناسبة.

جمع الخلايا المستهدفة في أنبوب سعة 15 milliliter، يحتوي على ثمانية milliliter من وسط RPMI الكامل. ولتوليد مجموعة غنية جداً من خلايا PDCM، من الضروري فرز المجموعة الصحيحة من خلايا CLP من خلايا نخاع العظم المجمعة من أجل زراعتها في المختبر باستخدام نظام Z six feeder. في نهاية عملية الفرز، قم بطرد الخلايا مركزياً ثم أعد تعليق كتلة خلايا CLP باستخدام كمية كافية من وسط RPMI الكامل للحصول على كثافة خلوية تبلغ حوالي 5 × 10⁴ خلية لكل milliliter.

بعد ذلك، قم بزراعة 500 خلية لكل بئر في لوحة ذات 12 بئراً تحتوي على خلايا AC six المغذية، ثم عزز المزارع المشتركة بـ 100 nanograms per milliliter من ربيطة FL three، ثم حضن الخلايا عند 37 °C و 5% carbon dioxide مع المراقبة البصرية الدورية لتطور الخلايا التغصنية أو DC تحت المجهر. وفي اليوم 12، قم بحصاد الخلايا الموجودة في الطافي الخاص بالمزارع المشتركة واغسل كل بئر مرة واحدة باستخدام half a milliliter من وسط RPMI الكامل، مع تجميع الطافي والغسلات الناتجة. ثم أضف half a milliliter من الوسط الطازج إلى كل بئر واستخدم كاشطة الخلايا لفصل الخلايا الملتصقة.

اجمع الخلايا المنفصلة مع الخلايا العائمة ثم قم بطرد سائل تعليق الخلايا الناتج مركزياً. أعد تعليق الراسب في 50 µL من fax buffer. بعد ذلك، قم بعد الخلايا وصبغها للكشف عن تعبير CD 11 C وCD 11 b وB two 20 بعد إجراء حجب FC.

كما تم توضيحه للتو، يمكن بعد ذلك تحليل الخلايا المستزرعة مشتركاً للكشف عن وجود مجموعات الخلايا التغصنية (DC) التقليدية الموجبة لـ CD 11 C والموجبة لـ CD 11 B والسالبة لـ B20، والخلايا التغصنية الشبيهة بالبلازمية الموجبة لـ CD 11 C والسالبة لـ CD 11 B والموجبة لـ B20، وبإجمالي يتراوح من 4 إلى 6 × 10⁷. يتم عادةً عزل خلايا نخاع العظم من عظام الفخذ والقصبة لفئران من النوع البري C57BL/6 يتراوح عمرها بين 6 إلى 8 أسابيع، حيث يتم الحصول عادةً على 5 × 10⁴ من سلائف الخلايا اللمفاوية المشتركة (CLPs) من فأر واحد من سلالة C57BL/6. وبعد الفرز بواسطة قياس التدفق الخلوي كما تم توضيحه للتو، وبحلول اليومين الثالث والرابع من الاستزراع المشترك مع خلايا AC6 المغذية، تبدأ الخلايا المكونة لمنطقة الرصيف (cobblestone area forming cells) في الظهور، مع ظهور الخلايا التغصنية الشبيهة بالبلازمية ذات الشكل المستدير معلقة فوق الخلايا المكونة لمنطقة الرصيف.

بحلول اليوم الثامن، تصل أعداد الخلايا التغصنية البلازمية (plasma cyto DC) إلى ذروتها في الفترة ما بين اليومين 12 و14، وعند هذه النقطة تبدأ الخلايا في الخضوع للموت الخلوي المبرمج (apoptosis) بعد اكتمال تطورها، وتبدأ أعدادها في التناقص تدريجياً. أما مستعمرات الخلايا التغصنية التقليدية (Conventional DC) فتظهر لاحقاً في اليوم السادس إلى الثامن، وتكون ملتصقة وذات شكل مغزلي أكبر. ويظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن المزارع المشتركة تتكون من 91% من الخلايا التغصنية البلازمية ذات الواسمات CD 11 C positive وCD 11 B negative وB two 20 positive، و6% من الخلايا التغصنية التقليدية ذات الواسمات CD 11 C positive وCD 11 B positive وB two 20 negative، مما يكشف عن تمدد في أعداد الخلايا التغصنية البلازمية بمقدار 100 ضعف مقارنة بمجموعة السلائف اللمفاوية المشتركة (CLP) الأصلية باستخدام هذه الطريقة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم التأكد من أن خلية a c six في حالة جيدة وأن كثافة C صحيحة قبل إضافة clp بعد عملية التطوير. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في علم بيولوجيا DC للتغلب على القيد المتمثل في استخدام عدد صغير من المساقط لدراسة تطور DC من مساقط مختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد PCs في المختبر من CLP باستخدام نظام C six BEAT.