جيل من المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية من الإنسان الطرفية T الخلايا باستخدام سينداي الفيروسات في ظروف خالية من الطاعم

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات أو IPCs من الخلايا التائية الطرفية البشرية في ظروف خالية من المغذية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الطب التجديدي ، بما في ذلك كيفية تطبيق خلايا IPS في الاستخدام السريري. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن علاج خلايا IPS دون إدراج إعادة بناء الضرر المحتملة ، مما يقلل من خطر الإمراض.

يمتد تأثير هذه التقنية على العلاجات القائمة على خلايا IPS ذات الصلة سريريا في العالم بسبب, أخذ عينات الخلايا الغازية جنبا إلى جنب مع تقليل مخاطر تعريض خلايا IPS النامية لمسببات الأمراض غير محددة. لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للعلاج السريري لخدمة IPS. يمكن تطبيقه أيضا على مجالات أخرى مثل ظروف نمذجة الأمراض.

ابدأ في تحضير الخلايا التائية البشرية المنشطة عن طريق تخفيف 10 ملليلتر من الدم الكامل الهباريني باستخدام 10 ملليلتر من ماصة DPBS. 15 ملليلتر من محلول فول في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. قم ببسط الدم المخفف الذي يمتد على طول الجدار الداخلي للأنبوب إلى طبقة فوق المحلول.

احرص على عدم إزعاج الواجهة. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 مرة G لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي ، لاحظ ثلاث طبقات ، بما في ذلك طبقة سفلية شفافة ، وطبقة بيضاء رقيقة تحتوي على خلايا أحادية النواة وطبقة بلازما حليبية علوية.

انقل طبقة الخلية أحادية النواة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر دون نقل أي محلول ثقب مناسب. بعد ذلك ، أضف DPBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 ملليلتر. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا ب 10 مل من DPBS ، والطرد المركزي للأنبوب عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. ثم أضف ملليلترا واحدا من وسط KBM 5 0 2 إلى الخلايا وقم بالعد باستخدام مقياس الخلوي الدموي لتحضير طبق ثقافة الخلية ، وقم بتغطية آبار صفيحة بستة آبار ب 10 ميكروغرام لكل مليلتر من محلول الأجسام المضادة المضادة للقرص المضغوط المضاد للإنسان في PBS. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة على الأقل.

بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الجسم المضاد من اللوحة ثمانية واغسلها مرة واحدة ببذور PBS الخلايا أحادية النواة بكثافة 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل سنتيمتر مربع في حجم إجمالي قدره ملليلترين من KBM 5 0 2 وسط في ألواح الآبار الستة المطلية تحتضن الخلايا لمدة ثلاثة إلى سبعة أيام دون تغيير الوسط ، عند هذه النقطة يجب أن تصل الخلية التائية إلى الطلاقة بعد الأيام الثلاثة إلى السبعة. انقل الخلايا التائية المنشطة بوسط إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وجهاز طرد مركزي بمعدل 200 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة SNAT وأضف ملليلتر واحد من KBM 5 0 2 الطازج المتوسط.

عد الخلايا واللوحة 1.5 مرات 10 إلى الخلايا الست في ملليلترين من KBM 5 0 2 وسط في كل بئر من مضاد للقرص المضغوط ثلاثة أجسام مضادة مطلية بستة ألواح جيدة بعد ذلك إذابة OC ثلاثة SOX اثنين ، KLF أربعة ، و C-M-Y-C-H ، و L Sendi على الجليد في كل فيروس سينداي مصمم هندسيا على حدة لكل بئر وتعدد العدوى 10. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. ثم اجمع الخلايا المصابة بماصة وانقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

الطرد المركزي للخلايا عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأضف ملليلترين من KBM 5 0 2 المتوسط. استبدل الخلايا في آبار صفيحة من ستة آبار واحتضانها لمدة 24 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا.

لتراجع الخلايا أولا ، قم بإذابة محلول مصفوفة الغشاء القاعدي عند أربع درجات مئوية طوال الليل ، قم بإذابة 0.2 مل من محلول التفكير في 10 ملليلتر من DMM F 12 ، صفيحة متوسطة ، خمسة ملليلتر من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي في أطباق 100 ملم. اترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل للسماح للمصفوفة بتغطية الطبق قبل بذر الخلايا. وفي الوقت نفسه ، اجمع الخلايا التائية المصابة بفيروس SAI في أنبوب مخروطي سعة 15 لترا وجهاز طرد مركزي عند 200 مرة G لمدة خمس دقائق.

ثم أعد تعليق الحنك في ملليلتر واحد من وسط KBM 5 0 2 الطازج ، وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي بعد فترة الحضانة التي تبلغ 30 دقيقة. قم بإزالة محلول مصفوفة الغشاء القاعدي من اللوحين ، ثم أعد تعليقه مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة وبشكل منفصل مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الست إلى 10 ملليلتر من وسط M-T-E-S-R الطازج ، وهو وسيط ثقافة خال من الخلايا المغذية ل IPSC. ماصة كل تعليق خلية إلى لوحة منفصلة 100 ملم.

احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا. تغيير الوسيط كل يومين بعد 20 إلى 30 يوما. يجب أن تظهر المستعمرات التي تشبه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية.

قم بإعداد ست ألواح حائط لتوسيع IPSC عن طريق احتضان مليلتر واحد من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي في كل بئر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي الوقت نفسه ، اعرض لوحات الاستزراع التي تحتوي على مستعمرات IPSC تحت مجهر استريو وعزل المستعمرات الفردية عن طريق كشطها بماصة سعة 20 ميكرولترا. انقل كل مستعمرة إلى بئر ولوحة حائط 96 تحتوي على 20 ميكرولترا من وسط M-T-E-S-R.

بعد نقل المستعمرات ، أضف 200 ميكرولتر من وسط M-T-E-S-R إلى كل بئر وقم بالماصة لأعلى ولأسفل لتعطيل المستعمرة. بعد إزالة محلول مصفوفة الغشاء القاعدي من ألواح البئر الستة ، قم بنقل الخلايا من مستعمرة فردية إلى كل بئر ، ثم أضف ملليلترين من وسط M-T-E-S-R ، واحتضان الخلايا في حاضنة ثقافة الخلايا وتغيير الوسط كل يومين باستخدام مزرعة خالية من المغذيات وتم إنشاء وسائط خالية من المصل ipsc من الخلايا التائية الطرفية البشرية. كشف تلطيخ الفلورسنت المناعي عن تعبير عن علامات الخلايا النموذجية متعددة القدرات ، بما في ذلك nano T ثلاثة أربعة SSEA four و TRA one 60 و TRA 180 1.

في هذه الخطوط المشتقة من IPSE. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تنفيذ جميع الخطوات ، مع مراعاة جميع اعتبارات العقم والسلامة الحيوية المهمة.