تقدير حجم الجذعية القولون الطفرات خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الطفرات الجسدية المظهرية في نازعة هيدروجين الجلوكوز ستة فوسفات أو جين G six PD في الخلايا الجذعية القولونية. بعد معالجة بعوامل سامة جينية مفترضة ، يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة أولا مع انتظار العامل لفترة مناسبة من الوقت للسماح لنسل الخلية الجذعية التي تحمل طفرة G six PD بملء القبو بالكامل ، والتضحية بالحيوان ، وإزالة القولون ، وتشكيله في لفافة سويسرية وتجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. الخطوة الثانية هي تحضير أقسام مجمدة بسمك سبعة ميكرون على شرائح من القولون باستخدام ناظم البرد.

يتم تسخين الأنسجة إلى 37 درجة مئوية ثم يتم إنشاء الآبار لكل تلطيخ الأنسجة حول أقسام الأنسجة. تتمثل الخطوة الأخيرة في احتضان أقسام الأنسجة بخليط تلطيخ G six PD ثم تحليل الأقسام تحت خلايا المجهر الضوئي مع G six PD نشاط البقعة الزرقاء ، بينما تظهر تلك التي تحتوي على طفرات نمطية بيضاء. في النهاية ، يتم استخدام القياس الكمي للكريبس المتحولة لتحديد تردد الطفرة.

تقيس هذه التقنية الطفرات الجسدية لنازعة هيدروجين الفوسفات الستة في الجلوكوز في الخلايا الجذعية ، وهذه هي مجموعة الخلايا الحرجة في تسرطن القولون. من خلال تحديد طفرات الخلايا الجذعية الجسدية ، من الممكن ربط تواتر الطفرات بحوادث سرطان القولون في المعالجة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول طفرات الخلايا الجذعية في القولون ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الكائنات الحية النموذجية الأخرى أو أنظمة الأعضاء.

إذا كان من الممكن تحديد مكانة الخلايا الجذعية ، فإن الأفراد الجدد في هذه الطريقة سيكافحون بشكل عام من أجل إعداد محلول MBT. الذوبان. يتطلب حل MBT اهتماما دقيقا بالتعليمات التفصيلية. لبدء تحضير محلول التلوين النسيجي عند ملليلترين من درجة الحموضة 7.4 عازلة الفوسفات إلى 35 مل من درجة حرارة القطع المثلى ، أو وسط OCT في أنبوب 50 مليلتر ورجها بقوة لتتحد باستخدام ورق الأس الهيدروجيني.

أكد أن المحلول هو حوالي 7.4 درجة الحموضة. بعد ذلك ، أكد الجلوكوز ستة فوسفات ومحلول DP وكلوريد المغنيسيوم المذاب في مخزن الفوسفات كما هو موضح في بروتوكول النص ومرة أخرى ، أن الرقم الهيدروجيني للمحلول يظل حوالي 7.4. أضف محلول M-M-P-M-S واخلطه بقوة.

يجب أن ينتج عن ذلك لف المحلول بورق الألمنيوم باللون الأحمر الداكن الشفاف لتقليل التعرض للضوء. إذا أصبح المحلول عكرا ، فيجب التخلص منه أثناء تسخين حمام الزيت. بشكل منفصل ، قم بإعداد خمسة ملليمولار نيترو أزرق إلى محلول تيراز أوليوم أو MBT عن طريق خلط 0.4 مل من ثنائي ميثيل فورماميد 0.4 مل من الإيثانول اللامائي و MBT في أنبوب ملليلتر بغطاء دائري O ، وأغلق الأنبوب بشكل غير محكم واتركه يغلي بقوة في حمام الزيت حتى يذوب MBT.

بعد ذلك ، اترك محلول MBT يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ثم أضفه إلى خليط تفاعل OCT. قد يتغير لون المحلول من اللون البرتقالي الأولي إلى الأحمر الداكن أو الأرجواني بمرور الوقت. بعد معالجة وإعداد الأقسام المجمدة كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم ببناء آبار لتلوين الأنسجة باستخدام غسالتين فولاذيتين مرتبطتين ببعضها البعض مع شحم السيليكون المناسب للعطر في قاعدة الغسالة وقطع المركز حيث سيتم وضع الحل باستبداله.

قبل الحرب ، تنزلق الأنسجة المجمدة في غرفة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، ضع الآبار على الشريحة لإحاطة أقسام الأنسجة بحوالي نصف ملليلتر من خليط تلطيخ G six PD المعد مسبقا لكل قسم من أقسام الأنسجة جيدا واحتضانها لمدة 45 إلى 50 دقيقة. قم بإزالة الشرائح من الغرفة الدافئة وقم بإزالة آبار الفولاذ المقاوم للصدأ بعناية من الشرائح.

ضع الشرائح على الحافة الطويلة وصفي خليط مزيج التفاعل ، متبوعا بغسل لمدة 30 إلى 60 دقيقة و 100 مللي مولار من الفوسفات. لإزالة الآثار النهائية لمحلول تلطيخ G six PD ، اشطف الشرائح والماء منزوع الأيونات لمدة خمس إلى 10 دقائق لإزالة عازلة الفوسفات المتبقية. أخيرا ، أغلق الأنسجة عن طريق إضافة جل الفلورو بالتنقيط إلى الشريحة وجففها لمدة 30 دقيقة للحصول على صور لتحليلها لاحقا.

ضع الشريحة على مجهر ضوئي واضبطها على أربعة تكبير DX. ثم التقط صورا لقسم الأنسجة الملطخة بكاميرا بدقة 5.0 ميجابكسل لتقدير العدد الإجمالي للخبايا التي تم فحصها. لكل ماوس، حدد قسما من المستوى بأصغر مساحة سطح وقم بتصويره بتكبير 10 ×.

عد عدد الكريبس الطافرة. وفقا للمعايير التالية ، فإن القبو بأكمله خال من اللون الأزرق. الهيكل الخارجي للسرداب سليم.

لوحظ الطفرة في أقسام سبعة ميكرون مجاورة ومراقبان يحددان نفس القبو على أنه متحول. احسب بصريا عدد الخبايا في هذا القسم واضرب في عدد المستويات التي تم فحصها لكل نقطتين. يمكن رؤية أمثلة على Crips الطافرة في الفئران المعالجة بعامل ضار بالحمض النووي ، يمكن رؤية أزوكسي ميثان هنا على اليسار ترى عرضا رأسيا أو من أعلى إلى أسفل لقبو متحور.

بينما يوجد على اليمين منظر أفقي أو جانبي ، لكي يتم إعلان القبو متحورا ، يجب أن تظل جميع الخلايا داخل القبو قائمة. ترجع الخبايا البيضاء التي تحتوي على كمية صغيرة من اللون الأبيض إلى إنتاج المخاط من خلايا الكأس. يتم حساب تكرار الطفرة على أنه عدد الطفرات التي لوحظت مقسوما على العدد الإجمالي للخبايا التي تم فحصها بدون طفر.

لوحظت الكريبس في القولون من الفئران الضابطة التي تمثل تردد طفرة أقل من واحد في 10 إلى سالب خمس بينما أظهرت الفئران المعالجة بأزوكسي ميثان تردد طفرة في الخلايا الجذعية 4.44 في 10 إلى سالب أربعة بعد هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل التحليل الجيني لنوع طفرات نازعة هيدروجين الجلوكوز × الفوسفات من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفية خطأ العامل الكيميائي في ترميز الطفرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس طفرات الخلايا الجذعية الجسدية في الفئران المعالجة بمركبات محتملة مطفرات ومسرطنة.