فرز خلية العصبية الجذعية وخلايا السلف من الفأر Subventricular المنطقة الكبار وحية على التصوير من حيوية دورة الخلية الخاصة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تتبع تقدم الدورة الخلوية للخلايا الجذعية العصبية المفروزة ونسلها المعزولة من المنطقة تحت البطينية لفئران معدلة وراثياً تُعرف باسم فئران FCI، والتي تتميز بالتألق الفلوري المرتبط ببروتين ubiquitination في الدورة الخلوية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح المنطقة تحت البطينية لأدمغة الفئران البالغة المعدلة وراثياً. والخطوة الثانية هي تفكيك النسيج العصبي إلى معلق من الخلايا المفردة باستخدام معالجة بإنزيم الباباين.

بعد ذلك، يتم وسم المجموعات الخلوية العصبية المختلفة في المنطقة تحت البطينية باستخدام الأجسام المضادة من أجل تحديد الخلايا الجذعية العصبية الساكنة، والخلايا الجذعية العصبية المنشطة، والخلايا التضخيمية العابرة، بالإضافة إلى الأرومات العصبية غير الناضجة والمهاجرة. وتتمثل الخطوة النهائية في استخدام تقنية FACS لفرز الخلايا مباشرة في وسط زراعي جديد قبل وضعها على أطباق مغطاة بـ poly D lysine. وفي النهاية، يتم استخدام المجهر بالفيديو بنظام التصوير الزمني المستمر لدراسة تطور الدورة الخلوية للخلايا المزروعة، حيث تومض الخلايا المعدلة وراثياً المختلفة بألوان فلورية في نقاط زمنية مختلفة خلال دورتها الخلوية.

يتيح الجمع بين تقنية فرز الخلايا وتقنية Fuji تصور وعزل المجموعات الخلوية المختلفة من المنطقة تحت البطينية، مما يسمح بدراسة الخصائص والديناميكيات في دماغ البالغين المتحرك. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في سياق الشيخوخة وأمراض الدماغ. في اليوم السابق للتجربة، يتم إضافة حوالي 200 µL من محلول poly D lysine بتركيز 10 µg/mL إلى كل بئر من ألواح ذات 96 بئراً جدرانها سوداء ومعقمة لطلاء قاع الآبار، ثم يتم تغطية اللوح وتحضينه طوال الليل عند 37 °C في اليوم التالي.

أزل محلول poly D lysine واشطف الآبار ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم قبل ترك الطبق ليجف داخل غطاء السحب تحت تدفق رقائقي لمدة ساعتين على الأقل. في حال عدم الاستخدام الفوري، تُحفظ الأطباق المطلية والمجففة عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى سبعة أيام.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول تفكيك الباباين (Papain) وعقمه بتمرير الخليط عبر مرشح بمسامية 0.2 ميكرون. قم بتدفئة المحلول مسبقاً إلى 37 °C قبل استخدامه. كما يجب تحضير محلول مثبط البروتياز بإضافة 0.7 mg/mL من التريبسين في المثبط من النوع الثاني (trypsin in inhibitor type two) إلى وسط TM F 12 المعقم.

قم بترشيح المحلول باستخدام مرشح 0.2 micron وقم بتدفئة المحلول مسبقاً إلى 37 °C قبل استخدامه. ضع المنطقة تحت البطينية المستأصلة حديثاً من دماغ فأر fucci red بالغ في طبق بتري يحتوي على 0.6% Glucose في PBS وقم بفرم النسيج حتى لا تبقى أي قطع كبيرة. بعد ذلك، انقل كل شيء إلى أنبوب سعة 15 milliliter وقم بالطرد المركزي عند 200 ×g لمدة خمس دقائق.

بمجرد تجميع النسيج في شكل كريّة، تخلص من السائل الطافي وأعد التعليق. علّق النسيج في واحد milliliter من papain الدافئ مسبقاً، والمضاف إليه 0.01 milligrams per milliliter من dna.One. حضّن الخليط لمدة 10 minutes في حمام مائي عند 37 degrees Celsius.

بعد ذلك، قم بالطرد المركزي مجددًا عند 200 ×g لمدة خمس دقائق وتخلص من supernatant. أضف 1 mL من محلول OVO MOID المسخن مسبقًا لإيقاف الهضم الإنزيمي. بعد ذلك، استخدم رأس ماصة دقيقة P 1000 للسحب والدفع بلطف 20 مرة لتفكيك الأنسجة المفرومة ميكانيكيًا إلى معلق من الخلايا المفردة أثناء عملية السحب بالماصة.

تجنب إدخال أي فقاعات هواء في المزيج لأن ذلك قد يسبب إجهاداً إضافياً للخلايا. قم بتمرير معلق الخلايا عبر مرشح معقم بمسامية 20 micron في أنبوب جديد سعة 15 milliliter. اغسل مرشح الخلايا باستخدام 2 milliliter من PBS يحتوي على 0.15%BSA لتجنب فقدان الخلايا.

بعد ذلك، يتم طرد معلق الخلايا مركزياً عند 200 ×g لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الطافي. قم بإجراء صبغ FACT عن طريق تعليق الخلايا من كل فأر أولاً في 100 µL من PBS يحتوي على 0.15% BSA.

استخدم عُشر الخلايا المأخوذة من أحد الفئران لتحضير كل من الضوابط الأربعة وفقاً لما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. أضف الأجسام المضادة الأولية المدرجة هنا إلى كل أنبوب من الأنابيب المستخدمة لفرز الخلايا، ثم حضّن المزيج لمدة 20 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة 4 °C. بعد التحضين مع الأجسام المضادة الأولية، اغسل الخلايا باستخدام 1 mL من محلول PBS الذي يحتوي على 0.15%BS, A، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 200 ×g لمدة 10 دقائق.

أعد تعليق الخلايا في 200 µL من محلول PBS الذي يحتوي على 0.15% BSA لكل دماغ، وانقلها إلى أنابيب فرز مناسبة. ضع أنابيب فرز الخلايا على الثلج وأضف صبغة حيوية، مثل صبغة Hoechst 33342 بتركيز 2 µg/mL إلى الخلايا مباشرة قبل عملية الفرز للتمييز بين الخلايا الحية والميتة.

بعد ذلك، قم بتمرير الخلايا الموجودة في أنبوب الضابط السلبي عبر جهاز قياس التدفق الخلوي واختيار الخلايا باستخدام معايير التشتت الجانبي والتشتت الأمامي. استبعد الخلايا الميتة عن طريق تحديد البوابات للجزء السلبي فقط، واستبعد الخلايا المزدوجة عن طريق اختيار النبض مع الجزء السلبي. قم بتشغيل ضوابط اللون الواحد واضبط جهد أنابيب المضاعف الضوئي إذا لزم الأمر.

قم بإجراء تعويض الألوان في نافذة التعويض الخاصة بالبرنامج. قم بتشغيل ضوابط الفلورة الثلاثة ناقص واحد (fluorescence minus one) وارسم بوابات الفرز. بمجرد إعداد جميع البوابات، قم بفرز الخلايا الموصومة مباشرة في 100 µL من المزرعة.

قم بتوزيع الخلايا التي تم فرزها حديثاً في أطباق وسط بكثافة تتراوح من 1000 إلى 3000 خلية لكل بئر على أطباق ذات 96 بئراً مغطاة بـ poly de lycine مع إضافة 300 µL من وسط الزرع. قم بتحضين أطباق الزرع عند 37 °C و 5% carbon dioxide لمدة ساعة واحدة على الأقل.

للسماح بالتصاق الخلايا، قم بتجهيز مجهر المسح الليزري البؤري للتصوير عن طريق التسخين المسبق لغرفة التحكم في درجة الحرارة الملحقة إلى 37 °C تحت جو يحتوي على 5% carbon dioxide. ضع طبق الـ 96 well داخل غرفة المجهر المسخنة مسبقاً واضبط بؤرة التركيز على البئر الأول. بعد ذلك، افتح برنامج التصوير وانقر بزر الماوس الأيمن في النافذة الرئيسية لاختيار acquire acquisition controls ثم DEAC acquisition.

من أجل فتح لوحة TI واختيار الشيئية plan A PO VC 20 XDIC بعد ذلك، انقر على ضوابط الاستحواذ (acquire acquisition controls) ثم افتح خيارات التصوير الزمني (time-lapse options). حدد مركز كل بئر كموقع للمنصة، واختر خيار الصورة الكبيرة ليكون 7×7 mm². لاحظ الصورة الفسيفسائية حول مركز كل منها.

سنقوم بضبط نسبة التداخل لصورة الموزاييك الكبيرة عند 5%، وتحديد التردد بحيث يتم التقاط الصور كل 20 دقيقة لمدة 24 ساعة. ومن إعدادات OnePlus، اختر مستوى جهد أنبوب المضاعف الضوئي لكل فلورية مدرجة في شريط القائمة. اختر الحصول على الصور باستخدام ماسح رنين عالي السرعة بتنسيق 512 × 512 بكسل، واستخدم مجهر التباين التفاضلي (DIC) لتصوير الخلايا.

ثم اختر مجلداً لحفظ ملفات البيانات. انقر على زر "التشغيل الآن" (run now) في نافذة الحصول على بيانات ND لبدء عملية الحصول على البيانات. تابع العمل على جهاز الكمبيوتر لمدة دورة واحدة على الأقل للتأكد من أن كل شيء يعمل بشكل صحيح.

تم استخدام فئران Fuji red لتتبع طور G1 باستخدام الفلورة الحمراء عن طريق مجهر الفيديو بفاصل زمني. وتظهر الخلايا المعزولة فلورة حمراء خلال مرحلة النمو الأولى وتتغير ألوانها أثناء التصنيع، ومرحلة النمو الثانية، والانقسام الفتيلي. كانت النتائج إيجابية لـ Lex و FR و eeg.

تم زراعة الخلايا الموجبة لـ FR من فئران شابة وأخرى في منتصف العمر وتتبعها عبر المجهر. لم يظهر طول طور S وG2/M أي اختلاف بين الخلايا الموجبة لـ Lex والموجبة لـ EGFR والخلايا الموجبة لـ EGFR في كل من الفئران الشابة أو تلك التي في منتصف العمر. ومع ذلك، وُجد أن طول مرحلة النمو التالية من الانقسام الأول وحتى انطفاء الفلورسنت الأحمر كان أطول في الخلايا الأكبر سناً بسبب الزيادة في طول طور G1.

تكون الكرات العصبية التي يتم الحصول عليها بعد خمسة أيام من الزرع أصغر حجماً في خلايا Lex الموجبة وEGFR الموجبة التي تم الحصول عليها من الفئران الأكبر سناً. يجب ألا يتجاوز البروتوكول بأكمله ثلاث ساعات لعمليات التشريح وتحضير العينات، وثلاث ساعات أخرى لفرز الخلايا عند العمل مع 12 فأراً. ضع في اعتبارك أن العمل مع عدد كبير جداً من الفئران في اليوم نفسه سيؤدي إلى زيادة مدة فرز الخلايا، مما قد ينتج عنه زيادة في موت الخلايا أو تمايزها.