متعددة الوظائف، طريقة Micropipette القائم لتأسيس وتحفيز القنوات Mechanosensitive البكتيرية ايون في القطرة واجهة طبقات ثنائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة تشكيل قنوات mezcal وظيفيا في واجهة قطرات ، ونظام ثنائي الطبقة ، وفحص استجابة هذه القنوات الحساسة للميكانيكا للمنبهات الميكانيكية التوافقية. تتيح هذه الطريقة دراسة النشاط الكهربائي الميكانيكي لمتحور الميسكال V 23 T استجابة للإثارة الميكانيكية التوافقية بعد إعادة التكوين في واجهة قطرة بواسطة نظام طبقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم المزايا التقنية لكل من تقنية مشبك التصحيح وواجهة القطرات بطرق الطبقة مع القدرة على التصغير بالإضافة إلى القدرة على التحكم في التركيب الكيميائي لكل جانب من جوانب الغشاء.

لصياغة الجسيمات الشحمية ، قم بإعداد 10 ملليلتر من محلول دهني بمقدار ملليغرامين لكل مليلتر عن طريق إضافة 10 ملليلتر من محلول كلوريد البوتاسيوم إلى 20 ملليغرام من الدهون الاصطناعية D-P-H-P-C التي تم شراؤها كمسحوق مجفف. تأكد من خلط كل من المركبات الدهنية والمحلول العازل جيدا. يجب أن يبدو الخليط متجانسا وضبابيا عندما يذوب كل شيء.

قم بتجميد الخليط عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر الآن قم بإذابة خليط الدهون الجديد تماما ، واترك الخليط يذوب في درجة حرارة الغرفة وليس في بيئة ساخنة. بعد ما مجموعه ست دورات ذوبان الجليد ، استخدم الطارد المتاح تجاريا لبثق الدهون عن طريق إجبار تعليق الدهون بالكامل أولا من خلال مرشح غشاء بولي كربونات 0.4 ميكرون ، ثم ست مرات من خلال مرشح غشاء 0.1 ميكرون. تنتج هذه العملية جزيئات بأقطار قريبة من 100 نانومتر.

لتصنيع خزان النفط ، قم بحفر فتحتين متعارضتين من خلال جدار بقطر بوصتين وطول 1.5 سم من أسطوانة الأكريليك. يجب أن يكون قطر الثقوب ملليمترا واحدا وستيمترا واحدا من القاع. ثم قم بحفر فتحتين بحجم أربعة ملليمترات متحدة المركز إلى الثقوب التي تم حفرها مسبقا بمقدار واحد ملليمتر.

يجب أن تكون أعماق الثقوب ملليمترا واحدا لكل منها. احرص على عدم حفرها بالكامل. هذه الثقوب مصنوعة لتناسب الحشيات المطاطية.

ضع وألصقها حشيتين مطاطيتين بأقطار داخلية ملليمتر واحد في الثقوب الأكبر لمنع تسرب الزيت. ثم قم بلصق الماكينة لتكون على لوح أكريليك بسمك 10 سم × 10 سم باستخدام أي إيبوكسي متعدد الأغراض في يوم التجربة ، وقم بقص أسلاك فضية بطول سبعة سنتيمترات بقطر 2 250 ميكرون ، ثم اغمر أطرافها في التبييض لمدة ساعتين. لتشكيل طلاء كلوريد الفضة ، يشير اللون الرمادي إلى تكوين طلاء كلوريد الفضة.

باستخدام قاطع زجاجي ، قم بتقسيم شعرية من زجاج السيليكات بطول 10 سم بقطر خارجي واحد ملليمتر وقطرها الداخلي 58 ملم إلى شعيريين شعريين بطول خمسة سنتيمترات. باستخدام حقنة سعة مليلتر واحد بإبرة طرف حادة عيار 18 ، املأ الشعيرات الدموية بهيدروجيل P-E-G-D-M-A لمنع الهيدروجيل المائي من التورم خارج الشعيرات الدموية. احتفظ بخلوص ثلاثة ملليمترات عند الأطراف وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء في الشعيرات الدموية.

أدخل أقطاب كلوريد الفضة والفضة في الشعيرات الدموية المملوءة بالهيدروجيل. عالج هيدروجيل P-E-G-D-M-A من خلال بلمرة صور الجذور الحرة عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة دقيقتين عند واط واحد باستخدام بقعة فوق بنفسجية ، يتم إعداد التجربة تحت قفص فاراداي مؤرض على اتصال أرضي على مضخم التصحيح. قم بتوصيل إحدى الماصات الصغيرة بحامل قطب كهربائي صغير مستقيم يحتوي على موصل ذكر.

ثم قم بتوصيل حامل القطب الكهربائي الصغير بمرحلة رأس مضخم التصحيح. لتوصيل مرحلة الرأس باللحام الأرضي ، قم بتركيب سلك نحاسي معزول بقياس 18 بموصل مناسب لمرحلة الرأس ، قم بتركيب مرحلة الرأس على مناور صغير يدوي ثلاثي المحاور عن طريق توصيل لوحة تثبيت مرحلة الرأس أولا بمناور الصغير ، ثم توصيل مرحلة الرأس بلوحة التثبيت. باستخدام البراغي المناسبة ، قم بتوصيل الماصة الدقيقة الثانية بالمشغل الخطي من خلال موصل مصنوع في المختبر ثم قم بتركيبهما على مناور ميكروم ثان.

يجب أن تكون الماصات الدقيقة متعارضة مع بعضها البعض ومحاذاة ومستوية أفقيا. بعد ذلك في قارورة زجاجية ، امزج 0.1 ملليلتر من الجسيمات الشحمية D-P-H-P-C مع 0.01 ملليلتر من محلول الجسيمات الشحمية البروتيا V 23 T mescal. باستخدام إبرة التعبئة الدقيقة قياس 34، املأ أطراف كلتا الماصات الدقيقة بمحلول بروتيني.

ضع الخزان في الجزء العلوي من المجهر العمودي وقم بتغذية الماصات الدقيقة من خلال الفتحات المتقابلة التي يبلغ طولها 1 ملليمتر. ثم املأ الخزان على السطح بسداسي العشرات لتشكيل القطرات الكروية عند طرف الماصات الصغيرة. استخدم ماصة صغيرة ثالثة بقطر 10 ميكرون من زجاج السيليكات الصغير المثبتة على مناور ميكرومتر ثالث لتوزيع محلول الجسيم الشحمي البروتيا المخفف V 23 T عند أطراف الماصات الدقيقة وتشكيل القطرات.

تحكم في حجم القطرات عن طريق تقليل الحجم أو زيادته حسب الرغبة ، واتركها ترتاح لمدة 10 دقائق حتى تتشكل الطبقات الأحادية تماما. ثم اجعل القطرات ملامسة طبقة. سيحدث التكوين في غضون دقيقة إلى دقيقتين.

بعد إعداد البرامج والمعدات كما هو موضح في بروتوكول النص ، استخدم كبل BNC لتوصيل إخراج مولد شكل الموجة بالمفتاح الأمامي لإدخال الأمر الخارجي. أرسل شكل موجة مثلثة 10 هرتز و 500 مللي فولت إلى مرحلة الرأس. باستخدام مناور ميكروم.

حرك الماصات الزجاجية الدقيقة أفقيا لتلامس القطرات حتى تتلامس قليلا وانتظر حدوث ترقق ثنائي الطبقة. يمكن رؤية تقدم عملية تكوين الطبقة الثنائية بصريا من خلال المجهر ويمكن مراقبته عن طريق القياس الحالي. اضبط حجم الطبقة الثنائية على حوالي 250 ميكرون في القطر عن طريق التحكم في موضع القطرة المثبتة على المشغل باستخدام المعالج ، ويمكن تقدير حجم الطبقة الثنائية بصريا من خلال المجهر.

بمجرد أن تتشكل الطبقة الثنائية وتصبح مستقرة ، قم بتحفيز القطرات عن طريق إرسال إشارة جيبية باستخدام مولد وظيفي لتحفيز بروتين الميسكال الذي يندمج في الطبقة الثنائية. أرسل شكل موجة جيبية بذروة 175 ميكرون إلى ذروة السعة وتردد 0.2 هرتز ودورة عمل 50٪ إلى وحدة التحكم في الخادم الكهربائي Pieto. يتم عرض التسجيل الحالي غير النمطي في الوقت الفعلي هنا.

تزداد السعة المقاسة للطبقة الثنائية فجأة مما يشير إلى ترقق وتكوين ثنائي الطبقات قبل أن يصل إلى حالة مستقرة. يمكن التحكم في الطبقة الثنائية عن طريق تغيير موضع القطرات عندما يتم تحفيز DIB ميكانيكيا مع الحفاظ على إمكانات تيار مستمر ثابتة عبر الغشاء. يولد طفرة V 23 T من mezcal أنشطة موثوقة بما في ذلك حالات الموصلة الفرعية بشكل أساسي وأحيانا أحداث الافتتاح الكاملة.

يحدث البوابات بشكل أساسي عند ذروة الضغط مما يشير إلى أنه مرتبط بزيادة توتر الطبقة الثنائية كما هو موضح في المؤامرة القطبية. هنا ، يتم تسليط الضوء هنا على قدرة هذه التقنية على استخدامها لاختبار أنواع أخرى من الجزيئات الحيوية. Ethin ، وهي قناة أيونية ذات بوابات جهد ، تزيد من نفاذية الغشاء عند تطبيق إمكانات الغشاء DC سيد واحد.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم كسر الشعيرات الدموية الزجاجية عن طريق الخطأ أو غير ذلك. يجب عليك إعادة تشغيل الإعداد والتأكد من توصيل جميع الأسلاك بعد تطويره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال القنوات المنشطة بالتمدد لاستكشاف طرق جديدة يمكن من خلالها نقل القوى الخارجية إلى بوابة القنوات الحساسة لآلية DIB المدمجة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكوين واجهة قطرات بالطبقات ، ودمج القنوات الحساسة للميكانيكا في الأغشية الاصطناعية وتحفيز هذه القنوات ميكانيكيا.