بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام

الهدف العام من هذا الإجراء هو التوصيف الكمي للاستجابة المناعية لنبات Arabidopsis diliana من خلال اختبار ترشيح بالحقنة مُحسَّن. ويتم تحقيق ذلك أولاً باستخدام الترشيح بالحقنة لإيصال البكتيريا يدوياً إلى الورقة عبر الفتحات الطبيعية التي تسمى sada. أما الخطوة الثانية فهي الحصول على أقراص من أنسجة الأوراق المصابة بعد ظهور أعراض المرض.

بعد ذلك، يتم استخلاص البكتيريا من أقراص الأوراق عبر التجانس عالي الإنتاجية. وتتمثل الخطوة النهائية في التخفيف المتسلسل والترسيب على أطباق عد البكتيريا لحصر المستعمرات. وفي النهاية، يمكن ربط النمو البكتيري داخل كل قرص ورقي بالقوة النسبية للاستجابة المناعية للنبات.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال مناعة النبات، مثل تحديد الجينات التي تساهم في استجابات الدفاع ضد الإجهاد الحيوي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية في أنها تتيح تقديرًا كميًا دقيقًا لنمو الممرض في أنسجة النبات المصابة، وتساعد في تجنب الخطأ التجريبي الناتج عن أخذ عينات من أوراق ذات حالات نمائية متفاوتة. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول الاستجابة المناعية للنبات تجاه العدوى بممرض بكتيري شديد الفوعة، كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مثل الاستجابات المناعية المحفزة بحمض الساليسيليك أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات.

بشكل عام، يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في إيصال البكتيريا إلى الورقة دون إحداث تلف في الأنسجة. سيقوم الباحث في مرحلة ما بعد الدكتوراه Hindu وطلبة الدراسات العليا shalu و yali Soon من مختبري بتوضيح الإجراء التالي. سيتم عرض مقايسة تعزيز القابلية للإصابة بالمرض في هذا الفيديو.

قبل البدء بالتجربة، قم بتحضير أطباق وسط King's B أو KB؛ حيث يتم تحضير لتر واحد من وسط KB الصلب وفقاً لما هو موضح في نص البروتوكول، ويُترك ليبرد على لوح تحريك مغناطيسي. وعندما يبرد الوسط لدرجة تسمح بلمسه، أضف الجلسرول بنسبة 80%، وكبريتات المغنيسيوم بتركيز 1 مولار، والستربتومايسين إلى الوسط، ثم صبّ الوسط في أطباق KB بحجمين مختلفين. يُستخدم طبق بتري الأصغر كطبق زراعة بكتيرية أساسي، بينما يُستخدم طبق بتري الأكبر كطبق لعد البكتيريا.

يُحفظ تخزين الأطباق عند درجة حرارة 4 °C قبل يومين من عملية تخطيط المقايسة. PSM ES 43 26. تُنقل البكتيريا من مخزون الجلسرول المجمد عند -80 °C إلى طبق مستنبت بكتيري من نوع KB strep، ثم تُحضن عند درجة حرارة 28 °C لمدة تتراوح من 24 إلى 48 ساعة في اليوم التالي.

ابدأ المزرعة السائلة في أنبوب اختبار معقم يحتوي على أربعة ملليلترات من وسط kb السائل الذي يحتوي على 50 ميكروجرام لكل ملليلتر من الستريبتومايسين. قم بالرج بسرعة 250 دورة في الدقيقة عند درجة حرارة 28 درجة مئوية طوال الليل. يتم تنمية نباتات Arabidopsis المستخدمة في التجربة تحت الظروف الموضحة في نص البروتوكول في نفس اليوم الذي يتم فيه بدء المزرعة البكتيرية السائلة.

قم بتحديد بتلات الورقتين رقم خمسة وستة باستخدام قلم تحديد غير حاد ومقاوم للماء لسهولة التعرف على الأنسجة المصابة عند أخذ العينات. ولتعزيز فتح الثغور وتسهيل دخول محلول المسبب المرضي إلى أنسجة الورقة، يتم ري النباتات جيداً عن طريق نقع الأصيص من الأسفل لمدة 20 دقيقة.

بعد مرور 20 دقيقة، قم بتصريف المياه الزائدة. وبذلك تكتمل عملية عدوى نباتات arabidopsis. يتم ذلك في اليوم التالي لبدء المزرعة السائلة.

انقل المزرعة البكتيرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter وقم بتدويرها بسرعة 9,600 Gs لمدة دقيقتين. وفي درجة حرارة الغرفة، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الكتلة البكتيرية باستخدام واحد milliliter من كلوريد المغنيسيوم المعقم بتركيز 10 millimolar، ثم خفف المعلق البكتيري باستخدام تسعة milliliters من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 millimolar في أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter. وبعد قياس الكثافة الضوئية للبكتيريا، خفف البكتيريا باستخدام كلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 millimolar حتى تصل الكثافة الضوئية النهائية OD 600 إلى 0.0002.

لأجل اختبار العدوى بـ EDS. تُستخدم حقنة بدون إبرة ذات طرف مسطح بسعة واحد ملليليتر، والمعروفة باسم حقنة الأنسولين، لعملية الترشيح. املأ الحقنة بـ 0.5 إلى 0.6 ملليليتر من المحلول البكتيري المخفف لضمان تحكم أفضل بكثير أثناء عملية الترشيح، ولا تملأ الحقنة إلى سعتها القصوى.

اكشف عن السطح السفلي للورقة بوضعها فوق طرف إصبع السبابة، ثم قم بضبط وضعية الورقة برفق بمساعدة الإبهام. ضع الحقنة بشكل عمودي مقابل سطح الورقة لضمان توزيع الضغط بالتساوي لتقليل تلف الورقة. حاول تجنب منطقة العرق الوسطي أثناء عملية التسلل.

اضغط المكبس ببطء لترشيح المحلول البكتيري. سيظهر دخول السائل إلى النسيج المتوسط للورقة من خلال تغير لون الورقة إلى درجة أدكن؛ قم بترشيح سطح الورقة بالكامل حتى لو تطلب الأمر محاولات متعددة. وبمجرد اكتمال عملية الترشيح، جفف الورقة بلطف باستخدام مناديل امتصاص لإزالة محلول الممرض الزائد.

افحص أنسجة الأوراق المصابة بصرياً للتأكد من وجود تلف. اترك النباتات التي تم حقنها لتجف لمدة تتراوح بين ساعة إلى ساعتين، ثم أعِد النباتات إلى ظروف نموها الأصلية. رُش قبة شفافة بالماء وغطِّ بها النباتات المصابة لمدة ساعتين.

بعد ذلك، قم بكسر القبة لإحداث فتحة تتراوح بين بوصتين إلى ثلاث بوصات، واتركها كذلك طوال الفترة المتبقية من تجربة العدوى، والتي تستغرق عادةً ثلاثة أيام. وقبل يوم واحد من قياس نمو المسبب المرضي، قم بتجفيف أطباق وسط KB مقاس 150 مليمتر في 15 مليمتر مسبقاً.

جفف الأطباق بتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة تقريبًا. ابدأ بمعالجة الأنسجة المصابة بعد ظهور التصلب الذي يشار إليه باصفرار الأنسجة المصابة في الأنماط الجينية القابلة للإصابة، ولكن قبل تطور الآفات النخرية. قم بتجهيز ستة أنابيب طحن لكل نمط جيني.

ضع كرة طحن واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ وأضف 500 µL من كلوريد المغنيسيوم المعقم بتركيز 10 mM في كل أنبوب. بعد ذلك، افصل الورقة المصابة عن النبات واستخدم ملقطاً لاقتطاع قرص ورقي بشكل عشوائي باستخدام خرامة ورق ذات ثقب واحد، ثم ضع قرصين ورقيين من نباتين مختلفين في كل أنبوب طحن. أغلق الأنابيب بإحكام، وقم بتجانس الأنسجة باستخدام جهاز تجانس عالي الإنتاجية بالسرعة القصوى لمدة 10 دقائق.

كرر هذه العملية عند الحاجة حتى يتم تجانس النسيج جيداً وتتحول المحاليل إلى اللون الأخضر نتيجة تحرر الكلوروفيل من الأوراق المصابة أثناء الانتظار. ولإجراء عملية التجانس، املأ كل بئر في الصفوف الستة الأولى من طبق زراعة ذو 96 بئراً بـ 180 µL من كلوريد المغنيسيوم بتركيز 10 mM. ثم انقل 20 µL من معلق النسيج المطحون إلى كل بئر في الصف الأول من طبق الـ 96 بئراً وامزجها عن طريق سحب السائل ودفعه بشكل متكرر باستخدام الماصة.

إذا تسببت شظايا الأنسجة الصغيرة في انسداد الطرف، قم بقصه بمقدار مليمتيرين إلى ثلاثة مليمتيرات للمساعدة في الحصول على الحجم الصحيح من المحلول لتوفير مساحة كافية للقطرة في الجزء العلوي من الصفيحة، مع توزيع الأنسجة من التركيبات الوراثية المختلفة في صفوف متبادلة. لتحضير تخفيف تسلسلي بعشرة أضعاف، انقل 20 µL من معلق الأنسجة إلى الصف الثاني وكرر هذا الإجراء حتى التخفيف السادس. باستخدام رؤوس ماصات مقسمة، انقل 20 µL من المحلول من صفيحة 96 ذات الجدران إلى صفيحة KB مقاس 150 mm في 15 mm.

ابدأ العمل من المعلق الأكثر تخفيفاً وصولاً إلى الأكثر تركيزاً، وذلك لتجنب الحاجة إلى تغيير رؤوس الماصة بين عمليات التخفيف. جفف الطبق في درجة حرارة الغرفة مع ترك الغطاء مفتوحاً قليلاً. وبمجرد عدم ملاحظة أي سائل على سطح الطبق، أغلق الغطاء واقلب الطبق ثم حضنه في درجة حرارة الغرفة.

قم بحضن الأطباق لمدة تتراوح بين 40 و 60 ساعة حتى تصبح المستعمرات مرئية. تأكد من أن البكتيريا الموجودة على الأطباق تعكس الانخفاض المتوقع بمقدار عشرة أضعاف في وحدات تكوين المستعمرات.

قم بعدّ البكتيريا قبل أن تنمو بشكل مفرط وتندمج المستعمرات. حدد عدد البكتيريا في أقل تخفيف لا يحتوي على مستعمرات متداخلة. عادةً ما يكون التخفيف المفضل للعد هو الذي يحتوي على ما بين 10 و 50 مستعمرة، وقد يختلف ذلك بين المكررات التقنية.

لحساب مستويات التكاثر البكتيري، حدد عدد الوحدات المكونة للمستعمرات لكل قرص ورقة باستخدام هذه الصيغة، حيث تمثل R رقم الصف و T عدد البكتيريا داخل كل مكرر تقني. تُستخدم هذه البيانات بعد ذلك لإنشاء رسم بياني، حيث يتم تمثيل كل نقطة بيانات كمتوسط لست مكررات تقنية على مقياس لوغاريتمي.

تمثل أشرطة الخطأ فاصل الثقة 95% لمتوسط المرض المتزايد. تم تقييم القابلية للإصابة بـ P-S-M-E-S 43 26 عن طريق العدوى بلقاح بكثافة بصرية OD 600 تبلغ 0.0002. وتظهر النتائج أن طفرات NPR 1 شديدة القابلية للإصابة لديها نمو ممرض أكبر بنحو 2.5 log أو 300 مرة مقارنة بنباتات Columbia 0 البرية.

يمكن تعديل مقايسة الارتشاح بالسرنجة لتقييم طبقات مختلفة من الاستجابة المناعية. ولتقييم المناعة التي يحفزها حمض الساليسيليك، يتم استخدام التطبيق الخارجي لساليسيلات الصوديوم لتحفيز الاستجابة المناعية، والتي يتم قياسها كمياً من خلال نمو الممرض. ويؤدي فقدان NPR1، الذي يعمل كمستقبل لحمض الساليسيليك ومنظم مشارك رئيسي لنسخ الجينات المستهدفة المعتمدة على حمض الساليسيليك، إلى عدم الحساسية تجاه التطبيق الخارجي لمشتق حمض الساليسيليك.

لتوصيف المناعة الناجمة عن الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروبات، عولجت النباتات مسبقاً بمحفزين معروفين. FLAG 22 و L 18، حيث أظهرت نباتات النوع البري Columbia zero المعالجة بـ FLAG 22 انخفاضاً بمقدار لوغاريتمي واحد أو 10 مرات في التعداد البكتيري، بينما فشلت النباتات الطافرة FLS two في تحفيز تأثير تقييد النمو البكتيري. وبالمثل، كانت النباتات الطافرة EFR غير حساسة للمعالجة المسبقة بـ L 18.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الاستجابة المناعية لـ Arabic opsys من خلال مقايسة الارتشاح بالحقنة. أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة تطور المرض وأخذ عينات من النسيج بعد ظهور corsis. يُعد pseudomona pather cul cola S phos 3, 2 6 ممرضاً نصف ضموري.

وبناءً على ذلك، يجب إجراء عملية أخذ العينات قبل الانتقال إلى المرحلة الغذائية العصبية. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (quantitative real time PCR) وتحليل Western للدم للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد مسار إشارات المناعة المحدد الذي تعرض للاضطراب. ولا تنسَ أنك تتعامل مع بكتيريا حية.

على الرغم من أن Pseudomonas Senge ليست ممرضة للبشر، يرجى تذكر التخلص بشكل صحيح من المواد الاستهلاكية الملوثة والنباتات المصابة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.