بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae Pathosystem

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيف الاستجابة المناعية لأرابيدوبسيس ديليانا كميا من خلال مقايسة تسلل المحقنة المحسنة. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخدام تسلل الحقنة أولا لتوصيل البكتيريا يدويا إلى الورقة من خلال الفتحات الطبيعية المسماة سادا. الخطوة الثانية هي الحصول على أقراص من أنسجة الأوراق المصابة بعد ظهور أعراض المرض.

بعد ذلك ، يتم استخراج البكتيريا من أقراص الأوراق من خلال التجانس عالي الإنتاجية. الخطوة الأخيرة هي التخفيف التسلسلي واكتشاف ألواح العد البكتيرية لتعداد المستعمرات. في النهاية ، يمكن ربط نمو البكتيريا داخل كل ورقة بالقوة النسبية للاستجابة المناعية للنبات.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال مناعة النبات ، مثل تحديد الجينات التي تساهم في الاستجابات الدفاعية ضد الإجهاد الحيوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطريقة الحالية هي أنها تسمح بالقياس الكمي الدقيق لنمو مسببات الأمراض في الأنسجة النباتية المصابة وتساعد على تجنب الخطأ التجريبي الناجم عن أخذ عينات من الأوراق ذات الحالة التنموية المتنوعة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للاستجابة المناعية للنبات للعدوى بممرض بكتيري خبيث ، ويمكن أيضا تطبيقها على أنظمة أخرى مثل حمض الساليسيليك أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بالميكروب التي تحفز الاستجابات المناعية.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة من أجل توصيل البكتيريا إلى الورقة دون تلف الأنسجة. سيتم توضيح الإجراء التالي من باحث ما بعد الدكتوراه الهندوسي وطلاب الدراسات العليا شالو ويالي. قريبا من مختبري ، سيتم عرض اختبار القابلية المعززة للإصابة بالأمراض في هذا الفيديو.

قبل التجربة ، قم بإعداد لوحات وسائط King's B أو KB لصنع لترا واحدا من الوسط الصلب KB كما هو موضح في نص البروتوكول واتركه يبرد على لوحة تحريك مغناطيسية. عندما يتم تبريد الوسائط للمس 80٪ من الجلسرين ، فإن كبريتات المغنيسيوم المولية والستربتومايسين على الوسائط ، اسكب حجمين مختلفين من لوحات وسائط KB. يعمل طبق بتري الأصغر كلوحة لزراعة البكتيريا الأولية ويعمل طبق بتري الأكبر كلوحة عد البكتيريا.

قم بتخزين الأطباق على درجة حرارة أربع درجات مئوية قبل يومين من خط الفحص. PSM ES 43 26. البكتيريا من مخزون سالب 80 درجة مئوية من الجلسرين على لوحة زراعة البكتيريا العقدية KB وتحتضن عند 28 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة في اليوم التالي.

ابدأ زراعة السائل في أنبوب اختبار معقم بأربعة ملليلتر من وسط كيلو بايت السائل يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الستربتومايسين. رج 250 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية طوال الليل. تزرع نباتات نبات الأرابيدوبسيس للتجربة في ظل ظروف مفصلة في نص البروتوكول في نفس اليوم الذي تبدأ فيه زراعة البكتيريا السائلة.

ضع علامة على بتلات الأوراق رقم خمسة وستة بعلامة حادة ومقاومة للماء لسهولة التعرف على الأنسجة المصابة عند أخذ العينات. لتعزيز فتح STA وتسهيل دخول محلول مسببات الأمراض إلى مياه الأوراق. النباتات جيدا عن طريق نقع الشقة من الأسفل لمدة 20 دقيقة.

بعد 20 دقيقة ، صفي الماء الزائد. يتم إجراء عدوى نباتات الأرابيدوبسيس. في اليوم التالي لبدء الثقافة السائلة.

انقل المزرعة البكتيرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر وقم بالدوران بسرعة 9 ، 600 جم لمدة دقيقتين. في درجة حرارة الغرفة ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية بمليلتر واحد من كلوريد المغنيسيوم المعقم 10 ملليمولار لتخفيف معلق البكتيريا بتسعة ملليلتر من 10 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلترا. بعد قياس الكثافة البصرية للبكتيريا ، قم بتخفيف البكتيريا بكلوريد المغنيسيوم 10 مللي مولار إلى OD 600 نهائي من 0.0002.

لمقايسة عدوى EDS. يتم استخدام حقنة غير حادة ذات نهاية مليلتر واحد ، والمعروفة باسم حقنة الأنسولين للتسلل. املأ المحقنة ب 0.5 إلى 0.6 مل من المحلول البكتيري المخفف للتحكم بشكل أفضل أثناء عملية التسلل ، ولا تملأ المحقنة بكامل طاقتها.

قم بتعريض السطح السفلي للورقة في الجزء العلوي من السبابة ، ثم بمساعدة الإبهام ، اضبط موضع الورقة برفق. ضع المحقنة عموديا على سطح الورقة لضمان التوزيع المتساوي للضغط لتقليل تلف الأوراق. حاول تجنب منطقة الوسط أثناء التسلل.

ادفع المكبس ببطء للتسلل إلى المحلول البكتيري. سيتم تصور دخول السائل إلى الميزوفيل الورقي كما هو موضح من خلال لون الورقة الداكن ، ويتسلل إلى سطح الورقة بالكامل حتى لو تطلب محاولات متعددة. بمجرد اكتمال التسلل ، امسح الورقة برفق بأنسجة ماصة لإزالة محلول مسببات الأمراض الإضافي.

افحص أنسجة الأوراق المصابة بصريا بحثا عن التلف. اترك النباتات المتسللة لتجف لمدة ساعة إلى ساعتين ، وأعد النباتات إلى ظروف نموها الأصلية. رش قبة شفافة بالماء وقم بتغطية النباتات المصابة لمدة ساعتين.

ثم قم بتكسير القبة لتوليد فتحة من بوصتين إلى ثلاث بوصات واتركها طوال الفترة المتبقية من تجربة العدوى ، والتي عادة ما تكون ثلاثة أيام. قبل يوم واحد من تحديد نمو مسببات الأمراض. قم بتجفيف ألواح الوسائط 150 ملم × 15 ملليمتر كيلوبايت.

جفف الأطباق عن طريق إبقائها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة تقريبا. قم بمعالجة الأنسجة المصابة بعد ظهور التصلب المشار إليه باصفرار الأنسجة المصابة في الأنماط الجينية الحساسة ، ولكن قبل تطور الآفات النخرية. لكل نمط وراثي ، قم بإعداد ستة أنابيب طحن.

ضع كرة طحن واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ وأضف 500 ميكرولتر من كلوريد المغنيسيوم المعقم 10 مللي مولار في كل أنبوب. بعد ذلك ، افصل الورقة المصابة عن النبات وقم بثقب قرص ورقة بثقب ورقي واحد باستخدام ملقط بشكل عشوائي ، ضع قرصين ورقيين من نباتين مختلفين في كل أنبوب طحن. أغلق الأنابيب ، وقم بتجانس الأنسجة باستخدام الخالط عالي الإنتاجية بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق.

كرر هذه العملية إذا لزم الأمر حتى تتجانس الأنسجة جيدا وتتحول المحاليل إلى اللون الأخضر بسبب إطلاق الكلوروفيل من الأوراق المصابة أثناء الانتظار. من أجل التجانس ، املأ كل بئر في الصفوف الستة الأولى من صفيحة ثقافة 96 بئر ب 180 ميكرولتر من 10 مللي مولار كلوريد المغنيسيوم. انقل 20 ميكرولترا من تعليق الأنسجة الأرضية إلى كل بئر من الصف الأول من لوحة البئر 96 واخلطها عن طريق سحب السائل بشكل متكرر لأعلى ولأسفل.

إذا تسببت شظايا صغيرة من الأنسجة في انسداد الحافة ، فقم بقصها بمقدار ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات للمساعدة في الحصول على الحجم الصحيح للمحلول لتوفير مساحة كافية للقطرة الموجودة أعلى اللوحة ، مما يسافر بين الأنسجة من الأنماط الجينية المختلفة في صفوف بديلة. لتحضير التخفيف التسلسلي عشرة أضعاف ، انقل 20 ميكرولترا من تعليق الأنسجة إلى الصف الثاني وكرر هذا الإجراء حتى التخفيف السادس. باستخدام أطراف ماصة مقسمة ، انقل 20 ميكرولترا من المحلول من لوحة الحائط 96 إلى لوحة كيلوبايت مقاس 150 ملم × 15 ملم.

اعمل من المعلق الأكثر تخفيفا إلى الأكثر تركيزا ، لذلك ليس من الضروري تغيير أطراف الماصة بين المخففة. جفف الطبق في درجة حرارة الغرفة مع تشقق الغطاء. بمجرد عدم ملاحظة المزيد من السائل على سطح اللوحة ، أغلق الغطاء المقلوب واحتضن اللوحة في درجة حرارة الغرفة.

احتضان الألواح لمدة 40 إلى 60 ساعة حتى تصبح المستعمرات مرئية. تأكد من أن البكتيريا الموجودة على الصفائح تعكس عشرة أضعاف يمكن التنبؤ بها. إسقاط في وحدات تشكيل المستعمرة.

عد البكتيريا قبل أن تنمو وتندمج المستعمرات. تحديد عدد البكتيريا في أدنى تخفيف لا تحتوي على مستعمرات متداخلة. عادة ما يحتوي التخفيف المفضل الذي سيتم عده على ما بين 10 و 50 مستعمرة ، وقد يختلف بين التكرارات التقنية.

لحساب مستويات التكاثر البكتيري ، حدد عدد وحدة تكوين المستعمرة لكل قرص ورقة باستخدام هذه الصيغة حيث R هو رقم الصف و T هو عدد البكتيريا داخل كل تكرار تقني. ثم يتم استخدام البيانات لإنتاج رسم بياني. يتم تمثيل كل نقطة بيانات كمتوسط لستة تكرارات تقنية على مقياس لوغاريتمي.

تمثل الأهوية فاصل الثقة بنسبة 95٪ لمتوسط المرض المعزز. تم تقييم القابلية للإصابة ب P-S-M-E-S 43 26 عن طريق العدوى بلقاح OD 600 من 0.0002. تظهر النتائج أن طفرات NPR شديدة الحساسية لها ما يقرب من 2.5 لوغار أو 300 مرة نمو مسببات الأمراض مقارنة بنباتات كولومبيا الصفرية من النوع البري.

يمكن تعديل مقايسة تسلل المحقنة لتقييم طبقات مختلفة من الاستجابة المناعية. لتقييم المناعة التي يسببها حمض الساليسيليك ، يتم استخدام التطبيق الخارجي لساليسيلات الصوديوم لتحفيز الاستجابة المناعية ، والتي يتم قياسها كميا عن طريق نمو مسببات الأمراض. يؤدي فقدان NPR R one ، الذي يعمل كمستقبل حمض الساليسيليك والتنظيم المشترك للنسخ الرئيسي للجينات المستهدفة المعتمدة على حمض الساليسيليك إلى عدم الحساسية للتطبيق الخارجي لمشتق حمض الساليسيليك.

لتوصيف النمط الجزيئي المرتبط بالميكروب الذي أدى إلى مناعة ، تمت معالجة النباتات مسبقا بمحفزين معروفين. FLAG 22 و L 18 ، دعمت نباتات كولومبيا الصفرية من النوع البري المعالج FLAG 22 سجلا واحدا أو 10 مرات انخفاضا في عدد البكتيريا بينما فشل النباتين الطافران FLS في تحفيز تأثير تقييد نمو البكتيريا. وبالمثل ، كانت النباتات الطافرة EFR غير حساسة للمعالجة المسبقة L 18.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد الاستجابة المناعية للعربي من خلال مقايسة تسلل المحقنة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة تطور المرض وأخذ عينات من الأنسجة بعد ظهور المكورس. السودومونا باثر كول كولا S phos 3 ، 2 6 هو عامل ممرض ضموري نصفي.

وبالتالي ، يجب إجراء أخذ العينات قبل الانتقال إلى مرحلة التغذية العصبية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي وتحليل الدم الغربي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل مسار الإشارات المناعية المعين الذي يتم إزعاجه. لا تنس أنك تعمل مع البكتيريا الحية.

على الرغم من أن Pseudomona Senge ليست مسببة للأمراض على البشر ، يرجى تذكر التخلص بشكل صحيح من المواد الاستهلاكية الملوثة والنباتات المصابة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.