طريقة بسيطة لحجم تجميع الشواهد من الكتل بلازميدة قليلة القسيمات مستقرة من جزيئات الذهب في ظل الظروف المحيطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج تجمعات قليلة القسيمات (oligomeric clusters) من جسيمات الذهب النانوية، والتي تتميز بكونها: عالية الاستقرار، وسهلة الاشتقاق، ولها أقطار محكومة بدقة عبر اختزال حمض الكلوروأوريك باستخدام ثيوسيانات الصوديوم. إن الجسيمات التي فحصناها اليوم مثيرة للاهتمام لأن أحجامها محكومة بدقة عالية، ونتيجة لذلك، يمكن استخدامها لدراسة نفاذية الأغشية للجسيمات ذات الأحجام المختلفة. وبما أنها مستقرة جداً في المحاليل البيولوجية، فإن هذه الخاصية تمنح هذه الجسيمات قدرة تحليلية قوية جداً.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في أنها تسمح بتخليق محكوم بدقة لعناقيد ذهبية قليلة القسيمات (gold oligoclusters) عالية الجودة في ظروف المختبر العادية، كما يمكن تنفيذها بسهولة باستخدام معدات معملية قياسية وعدد محدود من الكواشف. بعد تحضير جميع المحاليل اللازمة كما هو موضح في البروتوكول النصي، ابدأ عملية تخليق العناقيد الذهبية قليلة القسيمات بطريقة "زمن التأخير" عن طريق إضافة 7 milliliters من محلول Borax إلى زجاجة نظيفة سعة 125 milliliter تحتوي على 59.5 milliliters من الماء مع التقليب. بعد ذلك، أضف 2.8 milliliters من محلول كلوريد الذهب إلى الزجاجة، وهو ما يمثل بداية زمن التأخير الذي يحدد حجم العناقيد قليلة القسيمات.

أضف 700 µL من محلول ثيوسيانات الصوديوم إلى الزجاجة عند نهاية فترة التأخير. استمر في تحريك المزيج طوال الليل لإتمام تخليق العناقيد قليلة القسيمات (oligoclusters). عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم إضافة كلوريد الذهب ومحلول ثيوسيانات الصوديوم بسرعة إلى جميع الكواشف عند استخدام أحجام كبيرة من هذا المحلول، وذلك باستخدام موزعات واسعة الفوهة.

من أجل النمو الإضافي، اخلط 10 milliliters من العناقيد الذهبية قليلة القسيمات مع 60 milliliters من محلول كلوريد الذهب المـهدركسل. بعد ذلك، أضف 900 microliters من محلول ثيوسيانات الصوديوم مع التقليب الشديد. اترك الخليط يستمر في التقليب طوال الليل، حتى يكتمل التفاعل.

قبل إجراء عملية الاشتقاق، أضف 70 milliliters من العناقيد قليلة القسيمات (oligoclusters) الخام إلى مرشح طرد مركزي بحد قطع 30 kilodalton، وقم بالتدوير لمدة 15 minutes بسرعة 3,000 ×g. استعد الشريط المتبقي عن طريق قلب المرشح، والطرد المركزي لمدة 3 minutes بسرعة 500 ×g. بعد ذلك، قم بقياس الحجم المستعاد باستخدام ماصة دقيقة.

بعد ذلك، أضف حجماً من GSH يعادل تسع قيمة الحجم المستعاد من العناقيد قليلة القسيمات (oligoclusters). اترك التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن 10 دقائق. قم بتخفيف العناقيد قليلة القسيمات المشتقة في 50 milliliters من محلول Dulbecco's phosphate buffered saline لإيقاف التفاعل.

بعد ذلك، ضع مجموعات الأوليغو المشتقة في مرشح طرد مركزي بحد قطع يبلغ 30 kilodalton، ثم قم بتدويرها لمدة 15 دقيقة عند 3,000 ×g. وأخيرًا، استعد الشريط المتبقي عن طريق قلب المرشح، وتدويره لمدة ثلاث دقائق عند 500 ×g. تُحفظ مجموعات الأوليغو المشتقة بالجلوتاثيون عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

لتحليل العناقيد قليلة القسيمات (oligoclusters) الخام بواسطة الفصل الكهربائي للهلام، اخلطها بنسبة اثنين إلى واحد مع محلول التحميل المنظم. بعد ذلك، قم بتحميل 30 microliters من العناقيد قليلة القسيمات على هلام بولي أكريلاميد متدرج مسبق الصب. قم بتشغيل الهلام باستخدام محلول tris glycine المنظم لمدة 26 دقيقة عند 200 volts.

لإجراء الرحلان الكهربائي للهلام للعناقيد قليلة القسيمات المشتقة، قم أولاً بتخفيفها بنسبة واحد إلى ثلاثة باستخدام الماء. بعد ذلك، قم بتخفيف العناقيد بشكل أكبر بنسبة اثنين إلى واحد باستخدام منظم التحميل. قم بتحميل 10 µL من خليط العناقيد قليلة القسيمات على هلام بولي أكريلاميد متدرج مسبق الصب، ثم قم بتشغيل الهلام باستخدام منظم تريس جلايسين لمدة 26 دقيقة عند 200 فولت.

للتحليل باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ، اغسل 20 µL من العناقيد قليلة القسيمات (oligoclusters) المركزة باستخدام 0.5 mL من الماء، ثم حمّلها في مرشح طرد مركزي بسعة 0.5 mL وحد قطع 30 kDa. قم بالتدوير بسرعة 14,000 ×g لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أزل الراشح من الأنبوب، وأعد تعليق الراسب في 0.5 mL من الماء.

كرر عملية الغسل مرتين إضافيتين، ثم خفف تجمعات الأوليغومرات (oligoclusters) بمقدار 500 ضعف باستخدام الماء. بعد تفريغ الشبكة المغطاة بالكربون بالتوهج (glow discharging)، ضع 0.6 microliters من تجمعات الأوليغومرات على الشبكة، واتركها لتجف في الهواء لمدة 10 دقائق. وأخيراً، قم بتصوير تجمعات الأوليغومرات باستخدام تكبير 100, 000 x عند 80 kilovolts في المجهر الإلكتروني النافذ.

تم تحليل حجم العناقيد الذهبية قليلة القسيمات (gold oligoclusters)، التي تم تخليقها باستخدام إجراءات وقت التأخير والإضافة، عن طريق الفصل الكهربائي للهلام. وأظهرت المسارات من الثاني إلى الرابع في الهلام أن حجم العناقيد يزداد كلما زاد وقت التأخير. كما تؤكد المسارات من الخامس إلى الثامن أن حجم العناقيد يزداد أيضاً مع زيادة كمية الذهب المـهدركسل المستخدمة أثناء إجراء الإضافة.

استُخدم المجهر الإلكتروني النافذ لتحديد أقطار جزيئات العناقيد قليلة القسيمات. وحُسبت الأقطار عن طريق أخذ قياسات من صور لمساحات شبكية تبلغ 50 nanometer في 50 nanometer تحتوي على الجزيئات. كما رُسم بيانياً العلاقة بين حجم الجزيئات ووقت التأخير وكميات الذهب المضاف المـُهدركسل.

بعد ذلك، تم تحويل هذه البيانات إلى معادلات تنبؤية لأقطار الجسيمات لكل إجراء. إن طريقة تحضير عناقيد الذهب، والتي من المؤكد أنكم ناقشتموها، تعتمد على عملية هيدروكسلة كلوريد الذهب في محلول قلوي. وبناءً عليه، كلما زادت الهيدروكسلة، قلت احتمالية تكوين عنقود من الذهب.

يعد كتابي الجديد هنا هو الأول الذي أثار اهتمامي، لأنها المرة الأولى التي أدرك فيها أن عنصر زمن التعرض للمادة القلوية يمكن استخدامه للتحكم في حجم العناقيد. عند تنفيذ العملية بشكل صحيح، يمكن تخليق عناقيد ذهبية يتراوح حجمها من 3 إلى 70 nanometers في أقل من يوم واحد. وتتميز الجسيمات النانوية الناتجة باستقرارها في المحاليل المنظمة الفسيولوجية والبلازما، مما يجعلها مناسبة للتجارب التي تعتمد على الرؤية المباشرة.

تتميز عناقيد الذهب قليلة القسيمات (gold oligoclusters) الموصوفة هنا بميزة إضافية وهي إمكانية تركيزها دون الحاجة إلى اشتقاق مسبق، مما يسمح باستخدام كميات أقل من عوامل التجذير (rootization agents).