الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS

سلوك الخلايا الليفية يكمن وراء مجموعة من الكيانات السريرية ، لكنها لا تزال سيئة الوصف ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم تجانسها المتأصل. تعتمد أبحاث الخلايا الليفية التقليدية على التلاعب في المختبر ، وإخفاء سلوك الخلايا الليفية في الجسم الحي. نصف بروتوكولا قائما على FACS لعزل الخلايا الليفية لجلد الفئران الذي لا يتطلب زراعة الخلايا.

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الليفية باستخدام FACS ، وبالتالي التخلي عن الثقافة المختبرية ، والتي ثبت أنها تسبب تغييرا ظاهريا في هذه الخلايا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأحياء التنموي والتئام الجروح ، مثل كيفية تحديد الأنواع الفرعية للأرومات الليفية المتورطة في التندب والتليف. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يتم تجنب التجارب في المختبر مثل الالتزام بالبلاستيك ، والذكور إلى النمط الظاهري للأرومات الليفية.

لا يمكن لهذه الطريقة أن توفر نظرة ثاقبة على الخلايا الليفية الجلدية فحسب ، بل يمكن أيضا تطبيقها على أنظمة أخرى ، مثل الخلايا الليفية البريتونية والتصاقات البطنية. ابدأ بحلق وإزالة الشعر من الجلد الظهري للفأر محل الاهتمام. بعد ذلك ، اغمر الفأر المزخرف في 70٪ من الإيثانول وضع على سطح نظيف ومعقم حتى يجف.

بعد ذلك ، بدءا من قاعدة الذيل ، استخدم الملقط لخيمة الجلد وعمل قطع عرضي باستخدام مقص تشريح. ثم قم بتشريح الطائرة فوق اللفافية لحصاد الأنسجة الظهرية. عند إزالة قطعة من الجلد مقاس 60 × 100 ملم ، استخدم الحافة الحادة للمشرط لإزالة أي دهون تحت الجلد بعناية.

ثم اشطف الجلد المحصود في البيتادين ، متبوعا بخمس غسلات PBS على الثلج. باستخدام شفرات الحلاقة ومقص تشريح ، افرم قطع الأدمة في طبق معقم حتى يصبح حجم العينات بشكل موحد حوالي ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات. بعد ذلك ، قم بنقل شظايا الأنسجة من ما يصل إلى خمسة فئران إلى العدد المناسب من الأنابيب المخروطية الفردية سعة 50 مليلتر التي تحتوي على 20 مل من الكولاجيناز 4 في dmem.

حرك العينات بقوة عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة واحدة ، انقل الأنابيب إلى غطاء معقم وقم بتمرير الأنسجة من خلال حقنة 10 مليلتر لا داعي لها ثلاث إلى خمس مرات. أعد العينات إلى الخلاط لمدة 30 دقيقة أخرى ، متبوعة بثلاث إلى خمس ماصات أخرى مع حقنة سعة 10 مل.

بعد ذلك ، قم بتصفية العينات من خلال مصفاة 100 ميكرون في أنبوب جديد سعة 50 مليلتر واغسل الشبكة ب 20 مل من dmem ، مع استكمال FBS ليصل الحجم الإجمالي إلى 40 ملليلترا. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا واستخدم ماصة زجاجية معقمة لشفط الطبقة الدهنية العليا. عندما تتم إزالة المواقع الدهنية الملوثة ، استخدم ماصة زجاجية جديدة لإزالة باقي المادة الطافية وإعادة تعليق الكريات في 20 مل من dmem بالإضافة إلى FBS.

الآن ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 75 ميكرون وشطف الشبكة ب 10 مل من dmem بالإضافة إلى FBS. ثم قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وإزالة الدهون والمواد الطاففية كما هو موضح للتو. أعد تعليق الحبيبات في 20 مل من المخزن المؤقت FACS ، مع وضع كمية خمسة ملليلتر للتحكم غير الملطخ.

ثم قم بتدوير العينة المتبقية ، وتخلص من المادة الطافية وضع الحبيبات على الثلج. لعزل الخلايا الليفية بواسطة FACS ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من مزيج حضانة الأجسام المضادة للسلالة على الجليد. بعد 20 دقيقة ، امزج برفق خمسة ملليلتر من المخزن المؤقت FACS ، مع DNase مع الخلايا وقم بتدويرها.

اغسل الحبيبات في خمسة ملليلتر ثانية من DNase. بعد ذلك ، أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS و DNase ، مع الاحتفاظ بكمية 50 ميكرولتر من الخلايا للتحكم في صبغة البقاء. أخيرا ، أضف صبغة الجدوى إلى العينة المتبقية وفرز الخلايا وفقا للرسم التخطيطي.

يؤدي استخدام نهج استنفاد النسب السلبي بدلا من نهج الانتقاء الإيجابي إلى تجنب الاختيار المسبق لمجموعات سكانية فرعية معينة. يكشف تحليل المصفوفة الدقيقة للنسخ المسحوبة أن الخلايا الليفية المستزرعة المعزولة بواسطة منهجيات الحصاد الحي وزرع الأنسجة لها درجة عالية من التشابه على مستوى واسع من النسخ مع معامل ارتباط لحظة منتج بيرسون يبلغ 0.92. بالمقارنة ، اختلفت الخلايا الليفية المستنبتة اختلافا كبيرا عن الخلايا الليفية الحية غير المزروعة ، مما يثبت أهمية تحليل الخلايا الليفية الحية المحصودة على الخلايا الليفية المستنبتة.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا التنموية والتئام الجروح لتأكيد عدم تجانس الخلايا الليفية وتحديد المجموعات السكانية الفرعية المسؤولة عن التندب وأشكال التليف الأخرى.