نمذجة خطوات المبكر عن سرطان المبيض نشر في الثقافة عضوي النمط من البريتوني تجويف الإنسان

الهدف العام من هذه التجربة هو إنشاء نموذج عضوي يحاكي البيئة المكروية البريتونية لتحسين فهمنا لبيولوجيا سرطان المبيض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال سرطان المبيض ، مثل كيفية التفاعلات بين الخلايا السرطانية والبيئة المكروية التي تساهم في التسبب في المرض ، وكيف يمكن اختبار المثبطات المحتملة لهذه التفاعلات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الخلايا البشرية الأولية الفعلية التي تشكل أسطح خط الميزوثيليوم في تجويف الرحم تستخدم في الزراعة المشتركة لخلايا سرطان المبيض.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لسرطان المبيض ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على دراسة السرطانات الأخرى التي تنتشر في جميع أنحاء التجويف البريتوني ، مثل سرطانات المعدة والبنكرياس والقولون. عند الحصول على عينة من الثرب البشري الجراحي ، اغمر العينة على الفور في درجة حرارة الغرفة PBS. في غضون ساعتين من الغمر ، انقل الثرب إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 20 مل من PBS الطازج ، وقم بنقل غسل PBS المتبقي الذي يحتوي على خلايا الظهارة المتوسطة البشرية الأولية أو HPMC وخلايا الدم الحمراء إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مليلتر وقم بتدوير الخلايا.

ثم اسكب محتويات الأنبوب في طبق ثقافة معقم بطول 10 سم واستخدم مشرطين لفرم الأنسجة إلى خمس قطع مليمترات مكعبة. لعزل الخلايا الظهارية المتوسطة البشرية الأولية أو HPMC ، انقل قطع الثرب إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وانتظر دقيقة واحدة. لكي تطفو القطع الصلبة إلى الأعلى ، يستقر HPMC في الجزء السفلي من الأنبوب مع خلايا الدم الحمراء.

استخدم ماصة لنقل غسول PBS الذي يحتوي على خلايا الظهارة المتوسطة وخلايا الدم الحمراء وإلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المحببة وتدويرها إلى أسفل الخلايا. ثم أضف 20 مل من PBS الطازج إلى الثرب واجمع PBS الذي يحتوي على HPMC و RB C3 يتم عرضه مرات أخرى للخلايا المحببة الأصلية. بعد لوحة الدوران النهائية ، الخلايا الموجودة في قارورة مساحتها 75 سم مربع في 15 مل من وسط النمو الكامل.

لعزل HPMC إضافي من عينة الثرب ، رج الأنسجة الصلبة المتبقية في 20 مل من PBS عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية. بعد 10 دقائق ، اترك العينة ترتاح لمدة دقيقة واحدة للسماح للأنسجة الصلبة بالارتفاع إلى أعلى الأنبوب. ثم اجمع HPMC و RBC من قاع الأنبوب كما هو موضح للتو.

الآن ، قم بتدوير الخلايا من هذا الغسيل الثانوي ووضعها في قارورة منفصلة مساحتها 75 سم مربع في 15 مل من وسط النمو الكامل. لعزل أي HPMC متبقي ، قم بهز الأنسجة لمدة 10 دقائق أخرى هذه المرة في مزيج من PBS و 10 ملليلتر من tripsin EDTA وقم بوضع HPMC و RBC في قارورة مساحتها 75 سم مربع ثم احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في بيئة رطبة ، وتغذية الخلايا المطلية ب 15 مل من الطازجة ، وسط النمو الكامل في اليومين الثالث والخامس دون إزالة الوسط المستهلك. يمكن التعرف على HPMC من خلال شكلها المكعب وتعبيرها عن السيتوكيراتين ثمانية والمينتون.

لعزل الخلايا الليفية للثرب الطبيعي ، قم بمعالجة أنسجة الثرب المفروم المتبقية ب 10 ملليلتر من محلول الكولاجيناز من النوع الثالث المحضر حديثا 10 × المخفف في وسط خال من المصل لمدة ست ساعات مع الاهتزاز في نهاية فترة الحضانة ، ستصبح الأنسجة المهضومة معتمة مع المحلول الذي يحتوي على بعض الحطام الليفي ، وجهاز الطرد المركزي معلق الخلايا الليفية الثرب الطبيعي ، ثم الثقافة. الخلايا في 13 مل من وسط النمو الكامل. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط القديم ب 15 مل من وسط النمو الكامل الطازج.

يمكن التعرف على الخلايا الليفية الثرب الطبيعية من خلال شكلها الممدود المسطح ، وتعبيرها عن الفيمنتين وافتقارها إلى التعبير عن السيتوكيراتين. لتحرير الخلايا الليفية العادية من الثرب من المزرعة ، اشطف قارورة المزرعة ب 10 ملليلتر من PBS ، متبوعا بثلاثة ملليلتر من التربسين لمدة لا تزيد عن خمس دقائق. عندما تنفصل الخلايا ، قم بتحييد التربسين بما لا يقل عن ثلاثة أضعاف حجم وسط النمو الكامل ، وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

تدور أسفل الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط النمو الكامل. ثم عد الخلايا وقم بتخفيفها إلى اثنين إلى أربعة مرات 10 إلى الخلايا الليفية الثالثة لكل 100 ميكرولتر من النمو الكامل ، تركيز متوسط. بعد ذلك ، أضف 0.5 ميكروغرام لكل 100 ميكرولتر من كولاجين ذيل الفئران ، وواحد إلى الخلايا ولوحة 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في صفيحة بئر سوداء صافية 96.

ثم انقل اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة أربع ساعات على الأقل أو حتى تلتصق الخلايا بسطح الصفيحة ، بينما تستقر الخلايا الليفية ذات الزخم الطبيعي. افصل HPMC عن قوارير الاستزراع الخاصة بهم وقم بتخفيف هذه الخلايا إلى مرة إلى مرتين 10 إلى HPMC الرابع لكل 50 ميكرولتر من وسط النمو الكامل. ثم أضف 50 ميكرولترا من HPMC لكل بئر إلى الخلايا الليفية العادية المرفقة بالثرب ، وأعد اللوحة إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة 18 ساعة على الأقل قبل التجربة.

استخدم بذرة اليوم التالي ، الثقافات المشتركة ثلاثية الأبعاد العضوية مع GFP التي تعبر عن خلايا سرطان المبيض من 80 إلى 90٪ من الثقافة المتقاربة عند التخفيف المناسب لمقايسة المصب المطلوبة ، وببتيد RGD وحجب الأجسام المضادة ضد ألفا خمسة وبيتا واحد وألفا خمسة. بيتا ثلاثة. تمنع الإنتجرينات التصاق خلايا سرطان المبيض بالثقافة العضوية بينما لا تفعل الببتيد RAD والتحكم والأجسام المضادة للانتجرين الأربعة بيتا.

كما أن ببتيد RRG D والأجسام المضادة المانعة ضد ألفا خمسة وبيتا واحد إنتجرين تمنع أيضا تكاثر خلايا سرطان المبيض في ثقافة النمط العضوي بينما لا تفعل ببتيد RAD والأجسام المضادة للتحكم في ألفا خمسة وبيتا ثلاثة وبيتا أربعة إنتجرين ذلك. علاوة على ذلك ، فإن الببتيد RGD والأجسام المضادة الحجب ضد ألفا خمسة وبيتا واحد إنتجرين يثبط غزو ثقافة خلية سرطان المبيض 3D ORGANOTYPIC. في حين أن الجسم المضاد ألفا فايف بيتا ثلاثة إنتجرين يعزز هذه العملية كما هو متوقع من بيانات فحص الالتزام والانتشار ، فإن الببتيد RAD والتحكم والأجسام المضادة للإنتجرين بيتا أربعة لم تظهر أيضا أي تأثير على غزو الخلايا السرطانية.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون سبع إلى 12 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر دائما استخدام خزانة السلامة البيولوجية ومعدات الحماية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات الالتصاق والغزو والانتشار للإجابة على أسئلة إضافية حول تفاعلات الخلايا السرطانية مع البيئة المكروية بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال سرطان المبيض لاستكشاف كيفية تأثير البيئة المكروية على تفاعلات الخلايا السرطانية مع خلايا التجويف البريتوني البشري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الأولية عن الزخم البشري وكيفية بناء ثقافة عضوية للبطانة المحيطية.