حل الحيوي النووية الاستقطاب الأجهزة لفي الوقت الحقيقي القياسات الأنزيمية ردود الفعل قيم وNMR
فبراير 23, 2016
يتيح تعزيز الحساسية الذي يوفره الاستقطاب النووي الديناميكي للذوبان (DNP) متابعة عمليات التمثيل الغذائي في الوقت الفعلي بواسطة الرنين المغناطيسي النووي والتصوير بالرنين المغناطيسي. تتم مناقشة خصائص وأداء إعداد DNP المخصص للذوبان المصمم لدراسة التفاعلات الأنزيمية.
الهدف العام من هذه التجربة هو متابعة العمليات الأنزيمية في الوقت الفعلي عن طريق الاستقطاب النووي الديناميكي والرنين المغناطيسي النووي المعزز. يمكن أن يساعد الرنين المغناطيسي في الحالة السائلة المعزز بالاستقطاب النووي الديناميكي ، DNP ، في الإجابة على الأسئلة الرئيسية: كيفية تحديد ، على سبيل المثال ، معدلات التحول الأنزيمي لزوج من الجزيئات في الخلية أو في الجسم الحي دون الحاجة إلى تغيير هذا الزوج من الجزيئات بأي شكل من الأشكال. يعد تركيب معدات DNP القابلة للذوبان في مختبرنا ووصول الدكتور ريكاردو بالزان ، حاصل على درجة الدكتوراه في مختبر Arnaud Comment في لوزان ، خطوة كبيرة إلى الأمام لأبحاثنا.
يزيد DNP بشكل كبير من حساسية التجارب التي يمكننا إجراؤها على مطياف الرنين المغناطيسي النووي 500 ميجاهرتز. كانت معدات DNP هذه هي أول جهاز يتم تركيبه في فرنسا وأود أن أذكر أنه في جعل هذه المعدات وظيفية ، شارك جميع أعضاء فريق الرنين المغناطيسي النووي لدينا وأود أن أذكر على وجه الخصوص جيلداس بيرتو ، مهندس الأبحاث لدينا ، وفاتحة كاتب ، مديرة مؤتمراتنا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بالقياس الكمي المباشر في الوقت الفعلي للركيزة ومشتقاتها الداخلية بدقة زمنية قدرها الثواني.
بالنسبة لمحلول الاستقطاب ، قم بإعداد ملليلترين من محلول بيروفات الصوديوم المسمى 1.12 مولار ، الكربون 13 المخدر ب 33 ملليمولار من جذر TEMPO في حجم اثنين إلى واحد من الماء المنزوع للإيثانول المنزوع لملاحظات الكربون 13. قم بخفض درجة حرارة الاستقطاب النووي الديناميكي ، أو DNP ، من خلال إجراء التهدئة بالنقر فوق زر التهدئة على واجهة برنامج ناظم البرد. اجمع الهيليوم السائل في ناظم البرد DNP من خلال إجراء التعبئة.
انقر فوق زر التعبئة على واجهة برنامج cryostat. ثم ضع 300 ميكرولتر من محلول الاستقطاب المحسن في حاوية العينة المزودة بمستقطب DNP. قم بتجميد حاوية العينة مع العينة بداخلها عن طريق غمرها برفق في حمام النيتروجين السائل.
تخلص من النيتروجين السائل الذي قد يكون موجودا في حاوية العينة بعد إجراء التجميد عن طريق استخراج حاوية العينة من حمام النيتروجين السائل وتدويرها رأسا على عقب. بعد ذلك ، أدخل العينة في ناظم البرد عن طريق إدخال حاوية العينة أولا في حامل العينة. ثم ضع حامل العينة في ملحق ناظم البرد الرئيسي قبل إدخال موجه موجة الميكروويف في حامل العينة.
اخفض درجة حرارة ناظم البرد عن طريق بدء إجراء تبريد كلفن واحد. انقر فوق زر تبريد كلفن على واجهة برنامج ناظم البرد. قم بتشغيل مصدر الميكروويف وإشعاع العينة بالنقر فوق زر تشغيل أفران الميكروويف على واجهة برنامج cryostat.
افصل الكبل المحوري لقناة الكشف عن وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي من ملف مقياس الطيف عن طريق تدوير الموصل عكس اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة وسحبه. قم بتوصيل الكبل المحوري لقناة الكشف بالموصل المحوري لملف الرنين المغناطيسي النووي الناجم. ثم أدخل الموصل الذكر لكابل وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي في الموصل الأنثوي لملف الرنين المغناطيسي النووي الناجم عن البرد ، مع الانتباه إلى دبوس الاتجاه.
ادفع الموصل بقوة وقم بتدويره في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة. قم بقياس الإشارة الحرارية للرنين المغناطيسي النووي في الحالة الصلبة في موقع ناظم البرد باستخدام تسلسل بسيط لاكتساب النبض مع نبضات بزاوية قلب منخفضة غير معايرة تتكرر بفاصل زمني t يساوي خمس دقائق. بعد إعداد القياس ، اكتب zg في سطر الأوامر بالبرنامج واضغط على Enter على لوحة المفاتيح.
بعد بدء إجراء الاستقطاب ، قم بقياس إشارة الرنين المغناطيسي النووي المحسنة DNP في الحالة الصلبة بنفس الإجراء والشروط المستخدمة لقياس الإشارة الحرارية. افصل الكبل المحوري لقناة الكشف عن وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي عن ملف الرنين المغناطيسي النووي ناتج عن طريق تدوير الموصل عكس اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة وسحبه. ثم قم بتوصيل الكبل المحوري لقناة الكشف بالموصل المحوري لملف مقياس الطيف.
أدخل الموصل الذكر لكابل وحدة التحكم بالرنين المغناطيسي النووي في الموصل الأنثوي لملف مقياس الطيف ، مع الانتباه إلى دبوس الاتجاه. ادفع الموصل بقوة وقم بتدويره في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة. تحضير محلول LDH لعضلة الأرانب حديثا بوحدة واحدة لكل مليلتر في عازلة التفاعل مع 20 ميكروغرام لكل مليلتر من ألبومين مصل الأبقار.
بعد ذلك ، امزج 478 ميكرولتر من محلول التفاعل ، و 2 ميكرولتر من محلول LDH ، و 20 ميكرولترا من الماء المنزوع للسماح بتثبيت مجال مقياس الطيف ، أو القفل. ثم ضع حجم محلول 500 ميكرولتر في أنبوب رنين مغناطيسي 5 ملم. قم بتوصيل أنبوب النقل بجهاز حقن آلي مخصص يفصل المحلول شديد الاستقطاب عن غاز الهيليوم المستخدم في النقل.
يوفر الجهاز تلقائيا 500 ميكرولتر من محلول مفرط الاستقطاب في أنبوب العينة. قبل الذوبان ، ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي المكون من خمسة ملليمترات الذي يحتوي على 500 ميكرولتر من العينة في مركز متساوي مطياف الرنين المغناطيسي النووي 11.74 تسلا. أدخل 5 مل من الماء المنزوع في غلاية إدراج الذوبان.
قم بالضغط على الماء المنزوع وتسخينه عن طريق السلك المقاوم حتى تصل درجة الحرارة إلى حوالي 180 إلى 200 درجة مئوية بالنقر فوق زر إعداد السخان على واجهة برنامج ناظم البرد. انقر فوق SS Operations زر على واجهة برنامج cryostat. ثم قم بإزالة دليل الميكروويف من ملحق الذوبان.
حرك ملحق الذوبان لأسفل في حامل العينة. يجب أن يصل ملحق الذوبان إلى الجزء السفلي من حامل العينة ويجب دفعه بقوة لإجراء اتصال محكم للتسرب بحاوية العينة لتجنب تسرب المياه المنزوعة إلى ناظم البرد. اضغط على مشغل الجهاز لبدء تسلسل الذوبان، وهو تسلسل محدد مسبقا في الوقت المناسب لعمليات الصمامات الهوائية.
بعد الذوبان مباشرة ، يمزج جهاز الحقن 500 ميكرولتر من محلول مفرط الاستقطاب مع العينة الموضوعة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي. بعد الذوبان ، قم بقياس إشارة الرنين المغناطيسي النووي مفرط الاستقطاب من العينة في مقياس الطيف بسلسلة من 10 درجات ، وتسلسلات اكتساب نبض بزاوية الوجه متباعدة بمقدار 1.5 ثانية لمتابعة تقدم مغنطة الركيزة والمنتج. بعد إعداد القياس ، اكتب zg في سطر الأوامر بالبرنامج واضغط على Enter.
بمجرد استرخاء المغنطة تماما ، قم بقياس الإشارة الحرارية بالرنين المغناطيسي النووي بسلسلة من تسلسلات اكتساب النبض بزاوية 90 درجة متباعدة بحوالي ثلاث دقائق ، أي ما يعادل حوالي 3T1. بعد إعداد القياس ، اكتب zg في سطر أوامر البرنامج اضغط على مفتاح الإدخال. هنا يظهر المسار الزمني للأطياف التي تم الحصول عليها من نبضات زاوية الوجه المتكررة بزاوية 10 درجات الحساسية والدقة الزمنية للتقنية.
بعد تحديد ذروة ركيزة البيروفات ومنتج اللاكتات ، يتم إجراء القياس الكمي من خلال تكامل إشارة المستقلبات. يتم تحديد النشاط الأنزيمي من المسار الزمني لإشارة المنتج من خلال الملاءمة لنموذج خطي. للتحقق من صحة القياس ، يتم تقييم نفس الكمية من خلال معدل التفاعل الأولي ، من نسبة إشارات المنتج والركيزة.
بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء قياس كامل للنشاط الأنزيمي في غضون ساعتين تقريبا إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية إنتاج ركيزة شديدة الاستقطاب للرنين المغناطيسي النووي ، وحقنها في محلول يحتوي على إنزيم ، ومتابعة النشاط الأنزيمي باستخدام الرنين المغناطيسي النووي المحسن DNP. عند محاولة هذا الإجراء ، من المهم تحضير المحلول الأنزيمي بعناية باستخدام إنزيم جديد وركائز مساعدة ، وتجنب أي فقاعة هواء في أنبوب العينة.
مع تطوير الرنين المغناطيسي المعزز DNP في الحالة السائلة ، يمكن للباحثين الآن استكشاف امتصاص الركيزة وتحولها الأنزيمي داخل أنواع مختلفة من الخلايا عن طريق قياس معدل تكوين المنتج. لا تنس أن العمل مع المعدات المبردة والمجالات المغناطيسية العالية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء الحماية الشخصية ضد المبردات والتحقق من عدم وجود أجسام مغناطيسية أثناء إجراء هذه القياسات.
على عكس الرنين المغناطيسي النووي الكلاسيكي ، يقتصر الرنين المغناطيسي النووي المستند إلى DNP على نافذة زمنية تجريبية من الدقائق على الأكثر ، اعتمادا على الركيزة والحالة الحالية للحياة. هذا يقف في طريق تجاوز التحليل الطيفي D واحد. يحتاج الرنين المغناطيسي النووي DNP الذوبان إلى التطوير ليصل إلى مستوى تعدد استخدامات الرنين المغناطيسي النووي الكلاسيكي متعدد الأبعاد.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
الموجز
تناقش هذه الدراسة تنفيذ استقطاب نووي ديناميكي محلول (DNP) لتعزيز الحساسية في الرنين المغناطيسي النووي (NMR) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI). يركز على المراقبة في الوقت الحقيقي للعمليات الأنزيمية دون تغيير الجزيئات المعنية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- الرنين المغناطيسي النووي
الخلفية
- يزيد استقطاب DNP المحلول بشكل كبير من حساسية تجارب NMR.
- تتيح هذه التقنية القياس الكمي في الوقت الحقيقي للركائز ومشتقاتها.
- يمثل تركيب معدات DNP تقدمًا كبيرًا في قدرات البحث.
- كان التعاون بين أعضاء الفريق ضروريًا لتركيب معدات DNP.
غرض الدراسة
- لمتابعة العمليات الأنزيمية في الوقت الحقيقي باستخدام NMR المعزز بـ DNP.
- لتحديد معدلات التحولات الأنزيمية دون تغيير الجزيئات.
- لتحسين الحساسية التجريبية على مطيافية NMR بتردد 500 ميجاهرتز.
الطرق المستخدمة
- تركيب معدات DNP المحلول في المختبر.
- التعاون مع الباحثين ذوي الخبرة في تقنيات DNP.
- المراقبة في الوقت الحقيقي للتفاعلات الأنزيمية.
- استخدام مطيافية NMR بتردد 500 ميجاهرتز لزيادة الحساسية.
النتائج الرئيسية
- يتيح DNP القياس المباشر للركائز بدقة ثوانٍ.
- تسهل الحساسية المحسنة دراسة التفاعلات الأنزيمية.
- التركيب الناجح لمعدات DNP الأولى في فرنسا.
- كان التعاون بين أعضاء الفريق ضروريًا للنجاح التشغيلي.
الخلاصات
- استقطاب DNP المحلول هو أداة قوية لدراسة العمليات الأنزيمية.
- توفر التقنية رؤى في الوقت الحقيقي دون تغيير الهياكل الجزيئية.
- يمكن للبحوث المستقبلية الاستفادة من هذه التقنية في دراسات كيميائية حيوية مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Dissolution DNP-enhanced NMR enables real-time quantification of enzymatic reaction rates without molecular modification, addressing a critical sensitivity bottleneck in metabolic studies. This capability supports target validation by providing direct, quantitative readouts of substrate-to-product conversion in physiologically relevant systems. The method improves predictive confidence in early discovery by allowing kinetic assessment of enzyme activity under near-native conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of pyruvate-to-lactate conversion rates mediated by lactate dehydrogenase.
- Operational Value: Provides time-resolved enzymatic activity data with second-scale resolution, supporting rapid iteration in target engagement studies.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying flux through key metabolic pathways without perturbing native substrate or product identities.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time NMR readouts of metabolite formation, enabling assay standardization for enzymatic activity screening.
- Operational Value: Delivers reproducible signal integration and linear modeling outputs for consistent product signal time course analysis across experiments.
- Scalability Value: Supports platform reuse through automated injection and dissolution sequences that minimize manual handling and improve throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses pyruvate—a clinically relevant metabolic substrate—to model in vivo-like enzymatic transformations, supporting continuity from discovery to preclinical evaluation.
- Mechanistic Value: Enables monitoring of LDH-mediated flux, a known biomarker in tumor metabolism and drug response, aiding in pathophysiological relevance assessment.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides kinetic data that inform go/no-go decisions by quantifying enzymatic efficiency under controlled, reproducible conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling real-time enzymatic rate measurement after target identification and before lead optimization, supporting data-driven progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying flux through the pyruvate-lactate node, a central metabolic node in cancer and ischemia models.
- Screening: Enables assay readiness through standardized preparation of hyperpolarized pyruvate and consistent detection of lactate product via 10-degree flip angle pulse-acquire sequences.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements via signal integration and linear fitting of product signal time courses, enabling objective comparison of enzymatic conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of endogenous metabolites (pyruvate, lactate) that reflect in vivo metabolic pathways.
- Enterprise Reuse: Represents a modular capability for real-time metabolic flux analysis, adaptable to other enzyme-substrate pairs beyond LDH-pyruvate.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct, real-time quantification of enzymatic conversion.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized dissolution, injection, and acquisition protocols, minimizing variability in enzymatic rate measurements.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid assessment of enzyme activity, reducing reliance on indirect or endpoint assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering kinetic parameters that inform target druggability and pathway selectivity early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in DNP physics, cryogenics, and NMR operation to manage polarization, dissolution, and signal detection steps.
- Depends on specialized instrumentation including a DNP polarizer, cryostat, high-field NMR spectrometer (11.74 T), and automated injection device for hyperpolarized sample transfer.
- Necessitates cross-team standardization of enzymatic solution preparation (e.g., fresh LDH in buffer with BSA) and sample handling to prevent artifacts from air bubbles or delayed mixing.
- Involves adaptation considerations for non-pyruvate substrates, requiring re-optimization of polarizing agents, concentrations, and dissolution conditions for each target metabolite.
- Limited by the short hyperpolarized signal window (T1 or TLLS), necessitating rapid acquisition and constraining longitudinal studies beyond minutes.
![قياس الاسترخاء تدور شعرية الاعتماد المجال المغناطيسي من فرط الاستقطاب [1-13C] بيروفات](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59399.jpg%3Fv%3D2026-07-04T06%253A45%253A50.000Z&w=384&q=75)
