حل الحيوي النووية الاستقطاب الأجهزة لفي الوقت الحقيقي القياسات الأنزيمية ردود الفعل قيم وNMR

الهدف العام من هذه التجربة هو تتبع العمليات الإنزيمية في الوقت الفعلي عن طريق الرنين المغناطيسي النووي المعزز بالاستقطاب النووي الديناميكي. يمكن للرنين المغناطيسي في الحالة السائلة المعزز بالاستقطاب النووي الديناميكي، DNP، أن يساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية: كيف يتم تحديد، على سبيل المثال، معدلات التحول الإنزيمي لزوج من الجزيئات داخل الخلية أو في الجسم الحي دون الحاجة إلى تعديل هذا الزوج من الجزيئات بأي شكل من الأشكال. إن تركيب معدات DNP للإذابة في مختبرنا ووصول الدكتور Riccardo Balzan، الحاصل على درجة الدكتوراه من مختبر Arnaud Comment في لوزان، يمثل خطوة كبيرة إلى الأمام في أبحاثنا.

يزيد الاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) بشكل كبير من حساسية التجارب التي يمكننا إجراؤها على أجهزة مطياف الرنين المغناطيسي النووي (NMR) بتردد 500 ميجاهرتز. كانت هذه المعدات الخاصة بـ DNP هي الأولى التي يتم تركيبها في فرنسا، وأود أن أشير إلى أن جميع أعضاء فريق الرنين المغناطيسي النووي لدينا قد شاركوا في جعل هذه المعدات صالحة للتشغيل، وأخص بالذكر جيلداس بيرثو، مهندس الأبحاث لدينا، وفاتحة كاتب، أستاذة المحاضرات لدينا. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تسمح بالتقدير الكمي المباشر وفي الوقت الفعلي للمادة الركيزة ومشتقاتها الداخلية بدقة زمنية تصل إلى ثوانٍ.

لتحضير محلول الاستقطاب، قم بتحضير 2 mL من محلول بيروفات الصوديوم المسمى بالكربون 13 بتركيز 1.12 M، والمطعم بـ 33 mM من جذر TEMPO في حجم من الماء المديتر (deuterated water) إلى الإيثانول المديتر (deuterated ethanol) بنسبة اثنين إلى واحد من أجل ملاحظات الكربون 13. قم بخفض درجة حرارة مبرد الاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) من خلال إجراء التبريد عن طريق النقر على زر التبريد (cooldown) في واجهة برنامج المبرد. قم بتجميع الهيليوم السائل في مبرد DNP من خلال إجراء التعبئة.

انقر فوق زر التعبئة في واجهة برنامج المبرد المجهري (cryostat). بعد ذلك، ضع 300 µL من محلول الاستقطاب المحسّن في حاوية العينة المرفقة مع مستقطب DNP. قم بتجميد حاوية العينة وبداخلها العينة عن طريق غمرها بلطف في حمام من النيتروجين السائل.

تخلص من النيتروجين السائل الذي قد يكون موجوداً في حاوية العينة بعد عملية التجميد عن طريق إخراج حاوية العينة من حمام النيتروجين السائل وتدويرها رأساً على عقب. بعد ذلك، أدخل العينة في الكريوستات عن طريق وضع حاوية العينة أولاً في حامل العينة. ثم ضع حامل العينة في الجزء الداخلي الرئيسي للكريوستات قبل إدخال دليل الموجات الخاص بالميكروويف في حامل العينة.

قم بخفض درجة حرارة المبرد المبرد (cryostat) عن طريق بدء إجراء التبريد بمقدار واحد كلفن. انقر فوق زر التبريد بمقدار واحد كلفن في واجهة برنامج المبرد المبرد. قم بتشغيل مصدر الميكروويف وإشعاع العينة عن طريق النقر فوق زر تشغيل الميكروويف في واجهة برنامج المبرد المبرد.

افصل الكبل المحوري لقناة الكشف في وحدة تحكم NMR عن ملف المطياف عن طريق تدوير الموصل عكس اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة ثم سحبه. قم بتوصيل الكبل المحوري لقناة الكشف بالموصل المحوري لملف NMR الخاص بالمبرد (cryostat). بعد ذلك، أدخل الموصل الذكري لكبل وحدة تحكم NMR في الموصل الأنثوي لملف NMR الخاص بالمبرد، مع مراعاة مسمار التوجيه.

ادفع الموصل بقوة وأدره في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة. قم بقياس إشارة NMR الحرارية في الحالة الصلبة عند موقع المبرد باستخدام تسلسل نبضي بسيط (pulse-acquire sequence) بنبضات غير معايرة ذات زاوية قلب منخفضة تتكرر على فترات زمنية t تساوي خمس دقائق. بعد إعداد القياس، اكتب zg في سطر أوامر البرنامج واضغط على مفتاح enter في لوحة المفاتيح.

بعد بدء إجراء الاستقطاب، قم بقياس إشارة NMR المعززة بواسطة DNP في الحالة الصلبة باتباع نفس الإجراء والظروف المستخدمة لقياس الإشارة الحرارية. افصل الكابل coaxial لقناة الكشف في وحدة تحكم NMR عن ملف NMR في المبرد (cryostat) عن طريق تدوير الموصل عكس اتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة وسحبه. ثم قم بتوصيل الكابل coaxial الخاص بقناة الكشف بالموصل coaxial لملف المطياف.

أدخل الموصل الذكري لكابل وحدة تحكم NMR في الموصل الأنثوي لملف المطياف، مع مراعاة دبوس التوجيه. اضغط بقوة وأدر الموصل باتجاه عقارب الساعة بمقدار 90 درجة. قم بتحضير محلول LDH من عضلة أرنب حديثاً بتركيز unit/mL واحد في محلول منظم للتفاعل يحتوي على 20 µg/mL من bovine serum albumin.

بعد ذلك، اخلط 478 microliters من محلول التفاعل المنظم، و 2 microliters من محلول LDH، و 20 microliters من الماء المديتيريوم للسماح باستقرار مجال المطياف، أو تثبيته. ثم ضع حجم المحلول البالغ 500 microliter في أنبوب NMR بقطر 5 millimeter. قم بتوصيل أنبوب النقل بجهاز حقن آلي مصنع خصيصاً يعمل على فصل المحلول عالي الاستقطاب عن غاز الهيليوم المستخدم في عملية النقل.

يقوم الجهاز تلقائياً بضخ 500 µL من المحلول عالي الاستقطاب في أنبوب العينة. قبل عملية الإذابة، ضع أنبوب NMR بقطر 5 mm الذي يحتوي على 500 µL من العينة في المركز المتساوي (isocenter) لمطياف NMR بقوة 11.74 tesla. أضف 5 mL من الماء المديترن (deuterated water) في غلاية ملحق الإذابة.

قم بضغط وتسخين الماء المديترن بواسطة السلك المقاوم حتى يتم الوصول إلى درجة حرارة تتراوح تقريبًا بين 180 و 200 درجة مئوية، وذلك من خلال النقر على زر "prepare heater" في واجهة برنامج الكريوستات. انقر على زر "SS Operations" في واجهة برنامج الكريوستات. ثم قم بإزالة دليل الموجات الميكروية من قطعة إدخال الإذابة.

قم بتمرير ملحق الإذابة لأسفل في حامل العينة. يجب أن يصل ملحق الإذابة إلى قاع حامل العينة، كما يجب دفعه بإحكام لإنشاء اتصال مانع للتسرب مع وعاء العينة لتجنب تسرب الماء المديتريوم إلى الكريوستات. اضغط على مشغل الأجهزة لبدء تسلسل الإذابة، وهو تسلسل زمني محدد مسبقاً لعمليات الصمامات الهوائية.

مباشرة بعد عملية الإذابة، يقوم جهاز الحقن بخلط 500 microliters من المحلول عالي الاستقطاب مع العينة الموضوعة في مطياف NMR. وبعد الإذابة، قم بقياس إشارة NMR عالية الاستقطاب من العينة في المطياف من خلال سلسلة من تسلسلات النبض والاستحواذ (pulse-acquire sequences) بزاوية قلب قدرها 10 degree وبفاصل زمني قدره 1.5 seconds لمتابعة تطور المغنطة للمادة الخاضعة والمنتج. وبعد إعداد القياس، اكتب zg في سطر أوامر البرنامج واضغط على enter.

بمجرد استرخاء المغنطة تماماً، قم بقياس إشارة NMR الحرارية من خلال سلسلة من تتابعات نبضات الزاوية القلابة 90 درجة (pulse-acquire sequences) المتباعدة بفواصل زمنية تبلغ حوالي ثلاث دقائق، وهو ما يعادل حوالي 3T1. بعد إعداد القياس، اكتب zg في سطر أوامر البرنامج ثم اضغط على مفتاح enter. وهنا يوضح المسار الزمني للأطياف التي تم الحصول عليها من نبضات الزاوية القلابة 10 درجات المتكررة مدى حساسية ودقة التمييز الزمني لهذه التقنية.

بعد تحديد ذروة مادة البيروفات المتفاعلة ومادة اللاكتات الناتجة، يتم إجراء التقدير الكمي من خلال تكامل إشارة المستقلبات. ويتم تحديد النشاط الإنزيمي من خلال المخطط الزمني لإشارة الناتج عن طريق الملاءمة مع نموذج خطي. وللتحقق من صحة القياس، يتم تقييم الكمية نفسها عن طريق معدل التفاعل الأولي، من خلال نسبة إشارات الناتج والمادة المتفاعلة.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن إجراء قياس كامل للنشاط الإنزيمي في غضون ساعتين تقريبًا إذا تم تنفيذ ذلك بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم لكيفية إنتاج مادة ركيزة عالية الاستقطاب لتقنية NMR، وحقنها في محلول يحتوي على إنزيم، ومتابعة النشاط الإنزيمي باستخدام تقنية NMR المعززة بـ DNP. عند محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تحضير المحلول الإنزيمي بعناية باستخدام إنزيم وركائز مشتركة طازجة، وتجنب وجود أي فقاعات هواء في أنبوب العينة.

مع تطور الرنين المغناطيسي المعزز بالاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) في الحالة السائلة، أصبح بإمكان الباحثين الآن استكشاف امتصاص الركيزة وتحولها الإنزيمي داخل أنواع مختلفة من الخلايا عن طريق قياس معدل تكوين المنتج. لا تنسَ أن العمل باستخدام معدات التبريد الشديد والمجالات المغناطيسية العالية يمكن أن يكون خطيراً للغاية. لذا، يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة عند إجراء هذه القياسات، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية ضد المواد المبردة والتأكد من خلو المكان من الأجسام المغناطيسية.

على عكس الرنين المغناطيسي النووي (NMR) الكلاسيكي، يقتصر الرنين المغناطيسي النووي القائم على الاستقطاب النووي الديناميكي (DNP) بالإذابة على نافذة زمنية تجريبية لا تتجاوز دقائق معدودة، وذلك اعتماداً على المادة التحتية والحالة الحالية للتقنية. وهذا يعيق القدرة على تجاوز مطيافية البعد الواحد. لذا، يتطلب الرنين المغناطيسي النووي بـ DNP الإذابة مزيداً من التطوير للوصول به إلى مستوى المرونة الذي يتميز به الرنين المغناطيسي النووي الكلاسيكي متعدد الأبعاد.