توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام الحذف بوساطة CRISPR/Cas9 النوعي للأليلات لدراسة تنظيم نسخ الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام جينوم هجين لتوليد وتحليل عمليات الحذف أحادية الأليل. وبدلاً من ذلك، فهي تلغي الحاجة إلى تحليل عمليات الحذف المعززة أحادية الأليل التي قد لا تكون قابلة للحياة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الجينوميات الوظيفية، مثل: أي جين ينظمه معزز معين، ومدى اعتماد هذا الجين على أي معزز واحد من أجل نشاطه. وبينما يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول تعدد القدرات في الخلايا الجذعية، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى.

على سبيل المثال، يمكن أن يساعدنا ذلك في فهم كيفية تغيير الخلايا الجذعية لمصيرها لتصبح عصبونات، أو خلايا دم، أو عضلات. بعد تصميم وبناء وتأكيد تسلسل الحمض النووي الريبوزي الموجه، أو gRNA، المراد استخدامه، استعد لنقل البلازميدات الخالية من السموم الداخلية إلى خلايا ES. باستخدام جهاز طرد مركزي، قم بترسيب 1×10⁶ من الخلايا الجذعية الجنينية F1 الناتجة عن تهجين Mus musculus 129 مع Mus castaneus في أنبوب سعة 1.5 milliliter عند 300 ×g لمدة خمس دقائق.

بعد عملية الطرد المركزي، تخلص من السائل الطافي وأضف 100 µL من محلول إعادة التعليق المرفق من قبل الشركة المصنعة للمجموعة. ولحذف منطقة DNA المستهدفة، أضف 5 µg من كل من بلازميدات P Cas9 GFP 5-prime و 3-prime gRNA. ثم امزج المكونات برفق باستخدام الماصة.

تجنب إدخال أي فقاعات. بعد ذلك، استخدم رأس الماصة الإلكترونية في جهاز التثقيب الدقيق لسحب 100 µL من خليط التثقيب الكهربائي، مع الحرص على عدم إدخال الهواء في الرأس. ثم قم بتوصيل الماصة بجهاز عفن الخلايا.

اختر البروتوكول المناسب واضغط على زر البدء. وأثناء تشغيل عملية التثقيب الكهربائي (electroporation)، راقب الطرف. في حال كان الإعداد صحيحاً، يجب أن تظهر فقاعات صغيرة من قطب الأنبوب.

تشير الشرارة إلى وجود فقاعة هواء، وهو ما سيؤدي إلى تداخل مع عملية عفن الخلية (transfection). وفي حال حدوث ذلك، يجب تكرار عملية التثقيب الكهربائي (electroporation) باستخدام دفعة جديدة من الخلايا. بعد التثقيب الكهربائي، يتم إخراج الخلايا التي تم نقل الجينات إليها في طبق مغطى بالجيلاتين بقطر عشرة سنتيمتر يحتوي على عشرة ملليلتر من وسط زراعة خلايا ES.

يتم تحضين الخلايا المنقولة جينياً عند درجة حرارة 37 °C، ونسبة 5% من ثاني أكسيد الكربون. وبعد مرور 48 ساعة، استخدم جهاز قياس التدفق الخلوي لفرز وعزل خلايا ES الموجبة لـ GFP. بعد ذلك، يتم استزراع من 1 إلى 1.5 × 10⁴ من الخلايا الموجبة لـ GFP في طبق قطر 10 سم مطلي بالجيلاتين ويحتوي على 10 mL من وسط استزراع خلايا ES.

سيؤدي الزرع بهذه الكثافة المنخفضة إلى تسهيل عملية التقاط مستعمرات خلايا ES الفردية. وبعد مرور أربعة إلى خمسة أيام، استخدم المجهر لتحديد مستعمرات خلايا ES الفردية ذات الشكل الكروي. وباستخدام الماصة، انقل كل مستعمرة إلى بئر واحد من لوحة ذات 96 بئراً مُعالجة مسبقاً بالجيلاتين وتحتوي على 30 µL من tripsom.

بمجرد التقاط جميع المستعمرات وفصلها في الوسط الغذائي، يتم إنماء الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون حتى تتجاوز نسبة تلاقي الخلايا في معظم الآبار 70%. يستغرق هذا عادةً يومين تقريباً. وعندما تصبح الخلايا جاهزة للتقسيم، يتم إزالة الوسط الغذائي وإضافة 30 microliters من tripsom.

قم بتحضين الخلايا لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، أضف 180 µL من وسط زراعة خلايا ES إلى كل بئر لمعادلة مادة trypsin. استخدم الماصة في عملية السحب والدفع لتحقيق معلق خلوي أحادي.

قم بنقل 70 µL من كل بئر إلى كل من ثلاث لوحات 96-well مطلية بالجيلاتين تحتوي كل بئر فيها على 130 µL من وسط زراعة خلايا ES. يتم التحضين عند 37 °C. وعندما تصل اللوحات إلى نسبة تلاقي تتراوح بين 70 إلى 85%، تُستخدم لإجراء التنميط الجيني وتحليل التعبير الجيني لكل مستنسخ، كما هو موضح في الأقسام التالية.

قم بتجميد مخزونات الخلايا كما هو موضح في المستند المرفق. هنا، سيتم تصميم أربع مجموعات من البادئات لفحص المستنسخات بحثاً عن الحذف المطلوب. وتشمل هذه المجموعات: البادئات الداخلية، والبادئات الخارجية، والبادئات المحيطة بـ gRNA لكل من مواقع استهداف gRNA عند الطرف '5 والطرف '3.

ابدأ بزيارة الموقع الإلكتروني الموضح هنا للحصول على مسار تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (single nucleotide polymorphism) أو snip المقابل للأنماط الجينية 129 وCas. سينقلك هذا إلى صفحة CRISPR الخاصة بمختبر Mitchell. هناك، انقر فوق الرابط الموضح.

سيتم توجيه الموقع إلى متصفح جينوم UCSC الذي يحتوي على المسار الذي يعرض تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (snips) بين جينومي 129 و Cas في تجميع جينوم الفأر MM-9. بعد ذلك، أدخل إحداثيات المنطقة المراد حذفها، ثم انقر فوق "go". قم بتكبير منطقة تبلغ حوالي 500 base pairs في منتصف الحذف المطلوب بحيث تحتوي على أكثر من ثلاثة snips.

يمكن أن يكون تصميم البادئات النوعية للأليل معقداً إذا كانت تعددات أشكال النوكليوتيدات المفردة (snips) نادرة. وفي حال تعذر تصميم بادئات نوعية للأليل بشكل مطلق، يمكن استخدام بادئات نوعية للأليل بشكل متوسط. فقط تذكر مقارنة قيم CT بين المستنسخات المحذوفة وغير المحذوفة أثناء تحليل نتائج qPCR.

الآن، انقر على "View" في اللوحة العلوية. من القائمة المنسدلة، اختر "DNA". ستظهر صفحة "Get DNA in Window".

في خيارات تنسيق التسلسل، اختر "أحرف كبيرة" (all uppercase)، ثم انقر على "Get DNA" لعرض التسلسل المستهدف بتنسيق الأحرف الكبيرة بالكامل. انسخ هذا التسلسل وألصقه في ملف مستند Word. بعد ذلك، قارن التسلسل مع مسار 129 cast snip، وحدد مواقع الـ snip، وقم بتمييز الـ 129 snips باستخدام الأحرف الصغيرة.

عند الانتهاء من تسلسل 129، قم بنسخه لإنشاء تسلسلين بتنسيق fast day؛ أحدهما لـ 129 والآخر لـ Cas. في تسلسل Cas، استبدل القاعدة الصحيحة عند كل موضع snip، مع تمييز الـ snip بحرف صغير.

بعد ذلك، قم بتصنيف التسلسل بالجينوم المقابل له، 129 أو Cas. ثم، اكتب في المتصفح عنوان Primer3Plus. وفي المنطقة المخصصة، الصق تسلسل 129 الذي تم استبدال القطعة فيه.

استخدم الإعدادات الافتراضية لتصميم البادئات. لتصميم البادئات المحددة للأليل الداخلي، انقر فوق القائمة المنسدلة الموجودة على يمين "Task" واختر "Primer List"، ثم انقر فوق "Pick Primers". ستفتح صفحة جديدة تعرض قائمة بالبادئات الأمامية والعكسية.

قم بتحديد مربع الاختيار لاختيار بادئ أمامي أو عكسي يحتوي على تعدد شكل النوكليوتيدات المفردة (snip) مميز بحرف صغير إما عند النهاية '3 أو ضمن أربع قواعد من النهاية '3. لاحظ أن البادئات التي تحتوي على تعدد شكل النوكليوتيدات المفردة عند النهاية '3 تظهر نوعية أليلية متزايدة أثناء تفاعل qPCR. انقر فوق "Send to Primer3 Manager" في أسفل الشاشة.

ستفتح صفحة جديدة تعرض البادئ المختار. لاختيار البادئ الثاني، ارجع إلى صفحة قائمة البادئات، ثم انقر على زر الرجوع للعودة إلى الصفحة الرئيسية. من القائمة المنسدلة للمهام، اختر Detection.

ستتحدث الصفحة الرئيسية ويظهر مربعا لتسلسل البادئ الأمامي والخلفي في الأسفل. قم بلصق تسلسل البادئ الأول في المربع المناسب. بعد ذلك، انتقل إلى علامة تبويب الإعدادات العامة (General Settings) الموجودة بجانب علامة التبويب الرئيسية (Main) وقم بتغيير إعداد نطاق حجم المنتج ليكون من 80 إلى 200 base pairs.

انقر فوق "Pick Primers"؛ ستفتح صفحة تعرض خمسة أزواج محتملة من البادئات لتسلسل البادئة الأول. اختر مجموعة بادئات من قائمة أزواج البادئات عن طريق تحديد المربعات الموجودة على يسار البادئات، ثم انقر فوق "Send to Primer3 Manager" في أسفل الشاشة. ستكون هذه هي البادئات المحددة للأليل الداخلية 129.

كرر هذه الخطوات لتصميم بادئات للأليل cast. بعد ذلك، طبق هذه التقنية لتصميم بادئات خارجية محددة للأليل وبادئات غير محددة للأليل. وأخيرًا، اختبر خصوصية البادئات للأليلات باستخدام qPCR كما هو موضح في المستند المرفق.

استخلص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) من طبق الـ 96 بئراً الذي تم تحضيره مسبقاً. قم بطرد الطبق مركزياً لفترة وجيزة لترسيب أي تكثف في قاع البئر. سيعمل هذا الـ DNA كقالب لفحص الحذف.

بعد ذلك، قم بإجراء qPCR على لوحة ذات 384 بئراً، مع عمل نسخة مكررة لكل مستنسخ. استخدم PCR بخطوتين يليه تحليل منحنى الانصهار مع الكشف. بعد انتهاء التشغيل، تحقق أولاً من تضخيم كل أليل باستخدام البادئات النوعية للأليلات الداخلية.

يشير عدم تضخيم أحد الأليلات أو وجود فروق في قيمة CT تزيد عن خمس دورات بين الأليلات إلى أن هذه المستنسخات تحمل حذفاً متغاير الزيجوت. أما عدم تضخيم كلا الأليلين فيشير إلى أنها تحمل حذفاً متماثل الزيجوت. بعد ذلك، يتم فحص تضخيم كل أليل باستخدام البادئات الخارجية النوعية للأليل.

إذا كان الحذف المستهدف أكبر من 1 KB، فلن يحدث التضخيم باستخدام البادئات الخارجية إلا في حالة وجود الحذف. وتؤكد قيمة CT التي تتراوح بين 22 و28 حدوث الحذف. أما بالنسبة لعمليات الحذف المستهدفة التي يقل حجمها عن 1 KB، فيتم تأكيد حجم ناتج التضخيم عن طريق الرحلان الكهربائي.

تم فحص لوحة ذات 96 بئراً من مستنسخات الحذف بواسطة qPCR باستخدام بادئات داخلية محددة للأليل. تمثل الأشرطة الرمادية التضخيم الناتج عن بادئات محددة لـ Cas، بينما تمثل الأشرطة السوداء التضخيم الناتج عن بادئات محددة لـ 129. تشير قيمة CT منخفضة أو عدم حدوث تضخيم باستخدام البادئات الداخلية إلى حذف الهدف.

يتم بعد ذلك فحص المستنسخات التي تعاني من حذف في أحد الأليلين أو كليهما باستخدام البادئات الخارجية. حيث يؤكد التضخيم باستخدام البادئات الخارجية حدوث الحذف. أما المستنسخات التي تعاني من حذف أحادي الأليل، فيتم فحصها باستخدام بادئات تحيط بمناطق استهداف gRNA للتأكد من عدم وجود إقحامات أو حذف، والتي تسمى indels، في الأليل غير المحذوف.

تُستخدم فقط النسائل أحادية الأليل التي لا تحتوي على عمليات حذف أو إدراج (indels) كبيرة في المواقع المستهدفة على الأليل غير المحذوف في تحليل التعبير اللاحق. تظهر هنا نتائج ممثلة من 129 أو النسائل التي حُذف منها Cas SCR. يُعد SCR مُعززاً خاصاً بـ Sox2 تم وصفه مؤخراً في الخلايا الجذعية الجنينية (ES cells).

تمثل الأشرطة الحمراء تعبير أليل Sox2 Cas، بينما تمثل الأشرطة الزرقاء تضخيم أليل Sox2 129. وكما يتضح في هذا الشكل، أدى حذف SCR في أليل 129 أو أليل Cas إلى تقليل تعبير Sox2 في CIS. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إحداث حذف كبير باستخدام تقنية CRISPR واستخدام بادئات محددة للأليل لتحديد النمط الجيني للمستنسخات المحذوفة لديك.