ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق

الهدف العام من هذا الإجراء هو التعبير عن البروتينات السكرية الثديية مع إضافة أنماط الغلكزة الثديية المناسبة، وذلك من خلال توجيه البروتينات المؤشبة إلى الشبكة الإندوبلازمية (ER) ومسار الإفراز الذي يتوسطه جهاز جولجي (GOGI). يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في علم المناعة، مثل دور مواصفات معينة، والأنماط الموجودة في بنية الأجسام المضادة وشظاياها، وقدرتها على تنشيط الجهاز المناعي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في استخدام خلايا بشرية للتعبير عن بروتينات بشرية، مما يوفر الآلية الخلوية المناسبة لطي وتعديل البروتينات المستهدفة بشكل صحيح.

يجب تشغيل الهزاز الحاضن المخصص لتأسيس الخلايا عند 135 RPM، ورطوبة 80%، و8% ثاني أكسيد الكربون، و37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة على الأقل من تلقيح المزرعة. قم بتشغيل مصباح UV في كابينة السلامة البيولوجية، وقم بتدفئة زجاجات الوسط A والوسط B المختومة مسبقاً في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. أطفئ أضواء UV وقم بتعقيم كابينة السلامة البيولوجية بمحلول 70% إيثانول وماء.

قم بتعقيم دورق نمو إرلنماير سعة 125 milliliter بغطاء مهوى، والماصات، وأدوات السحب، وزجاجات الأوساط التي تم تسخينها مسبقاً، وذلك عن طريق الرش بمحلول 70%ethanol في الماء. ضع هذه الأدوات في كابينة السلامة البيولوجية طوال هذا الإجراء. يجب تعقيم جميع الأدوات بهذه الطريقة قبل إدخالها إلى كابينة السلامة البيولوجية.

قم بتحضير وسط استزراع طازج لاستزراع بحجم 30 milliliter عن طريق سحب 26 milliliters من الوسط A وثلاثة milliliters من الوسط B ونقلهما إلى دورق إرلنماير سعة 125 milliliter. امزج المكونات بالرج اللطيف، ثم قم بتدفئة قارورة من خلايا HEK 2 93 F المجمدة مسبقاً عند minus 80 degrees Celsius في حمام مائي عند 37 degrees Celsius لإذابة الخلايا جزئياً. تستغرق هذه العملية حوالي دقيقة واحدة، ويجب ألا تذوب الخلايا بالكامل.

بعد ذلك، قم بتعقيم الجزء الخارجي من القارورة باستخدام محلول الإيثانول 70% في الماء وانقلها إلى كبينة السلامة البيولوجية. باستخدام ماصة سعة 1 milliliter، اسحب معلق الخلايا وانقله إلى دورق إرلنماير سعة 125 milliliter يحتوي على 29 milliliters من وسط استزراع جديد. أغلق غطاء دورق الاستزراع وضع الدورق في الحاضنة الهزازة لمدة 24 hours.

بعد 24 ساعة من تلقيح المزرعة، يتم فحص كثافة الخلايا، وتعقيم دورق المزرعة بمحلول الإيثانول 70% والماء، ثم نقله إلى كابينة السلامة الحيوية. وباستخدام ماصة سعة 1 مل وأداة سحب السوائل، يتم سحب 100 µL من المزرعة ببطء ونقلها إلى أنبوب einor معقم سعة 0.5 مل.

أغلق غطاء دورق المزرعة وأعد دورق المزرعة إلى الحاضنة الهزازة في أسرع وقت ممكن. اخلط 7.5 µL من محلول tripan blue مع 7.5 µL من الخلايا. اخلط المزيج بقوة، ثم انقل 7.5 µL من المزيج إلى شريحة عد.

قم بتشغيل عداد الخلايا التلقائي وضع شريحة العد في غرفة التحميل. يتم تفعيل القارئ التلقائي وتُعد الخلايا آلياً بوحدات عدد الخلايا لكل ملليلتر ونسبة الحيوية. حدد حجم المزرعة المانحة المطلوب نقلها إلى وسط زرع جديد للحصول على كثافة خلوية تبلغ 300,000 خلية حية لكل ملليلتر.

قم بتحضير وسط زراعي طازج كما تم توضيحه سابقاً عن طريق نقل 23 milliliters من الوسط A وثلاثة milliliters من الوسط B إلى دورق زراعة طازج سعة 125 milliliter. بعد ذلك، قم بإزالة زجاجات مخزون الوسط A والوسط B من كابينة السلامة البيولوجية لتقليل مخاطر تلوثها. استخرج دورق زراعة خلايا HEK 2 93 F من الحاضنة.

قم برشها بمحلول الإيثانول 70% والماء وضعها في كابينة السلامة البيولوجية. وباستخدام ماصة جديدة، اسحب الحصة المحددة من الخلايا من المزرعة وانقلها إلى القارورة التي تحتوي على وسط زراعي جديد. انقل كلا المزرعتين من كابينة السلامة البيولوجية إلى الحاضنة الهزازة.

قم بتنمية الخلايا حتى تصل إلى كثافة تقريبية تتراوح بين 2 إلى 3 مليون خلية حية لكل milliliter قبل عملية transfection. تحقق من كثافة الخلايا كما تم توضيحه سابقاً وحدد كمية الخلايا اللازمة لـ transfection. باستخدام ماصة serological معقمة.

انقل الحجم المناسب من معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 250 milliliter. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 100 ×g لمدة خمس دقائق. بعد التعقيم، انقل الأنبوب الذي يحتوي على كتل الخلايا المترسبة إلى كبينة السلامة الحيوية.

استخدم ماصة معقمة لسحب السائل الطافي المكون من وسط الزرع المستهلك. أعد تعليق الخلايا المترسبة بقوة عن طريق السحب والطرد بالماصة باستخدام 10 milliliters من وسط زرع جديد، ثم انقلها إلى دورق مُجهز يحتوي على وسط زرع جديد لعملية التعداء. أحكم إغلاق غطاء دورق زراعة الخلايا المزود بفتحة تهوية، ثم احضن الدورق في الحاضنة الهزازة لمدة تتراوح من 15 دقيقة إلى ساعة واحدة أثناء فترة تحضين الخلايا.

قم بتخفيف مخزونات الـ plasma DNA والـ POLYETHERAMINE أو PEI باستخدام وسط استزراع حديث للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.5 micrograms per microliter. أخرج قارورة الاستزراع التي تحتوي على الخلايا المشتتة من الحاضنة الهزازة وانقلها إلى كابينة السلامة الحيوية، ثم استخدم ماصة دقيقة لإضافة 300 microliters من الـ plasma DNA إلى المزرعة واخلطها عن طريق الرج اليدوي اللطيف، ثم أضف 900 microliters من الـ PEI إلى المزرعة واخلط مرة أخرى. بعد ذلك، أضف 3.8 milliliters من وسط استزراع حديث.

انقل القارورة إلى الحاضنة الهزازة لمدة 24 ساعة. بعد مرور 24 ساعة من عملية عفن الخلايا (transfection)، يجب تخفيف المزرعة الخلوية. لتحضير وسط التخفيف أولاً، استخدم ماصة سيرولوجية معقمة سعة 1 milliliter لسحب 1 milliliter من حمض الفالبرويك (valproic acid) أو VPA بتركيز 220 millimolar المُسخن مسبقاً، وانقله إلى أنبوب معقم سعة 50 milliliter.

بعد ذلك، استخدم ماصة سيرولوجية معقمة لإضافة 5 milliliters من الوسط B المُدفأ مسبقاً و 44 milliliters من الوسط A المُدفأ مسبقاً إلى محلول VPA. سينتج عن ذلك 50 milliliters من وسط زراعي طازج بتركيز نهائي قدره 4.4 millimolar من VPA. استخرج المزرعة المنقولة جينياً من الحاضنة.

قم بتعقيم الجزء الخارجي من الدورق وضعه داخل كبينة السلامة البيولوجية. أضف وسط التخفيف المُحضّر إلى المزرعة. انقل الدورق مرة أخرى إلى الحاضنة الهزازة لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام إضافية بعد عملية التعداء.

راقب حيوية الخلايا يومياً وفقاً للإجراء الذي تم توضيحه سابقاً. يجب أيضاً حفظ حصص من الخلايا يومياً لتحليل تعبير البروتين، وذلك بعد خمسة إلى ستة أيام من عملية التعداء (transfection) أو إذا انخفضت حيوية الخلايا إلى أقل من 50%. يتم حصاد الخلايا عن طريق طرد الخلايا مع الوسط مركزياً عند 1000 ×g لمدة خمس دقائق. اجمع الطافي الذي سيحتوي على البروتين المفرز، ثم أضف 5 mL من محلول مبيض بتركيز 10% إلى كتلة خلايا HEK وتخلص منها كنفايات بيولوجية خطرة.

بعد ذلك، يتم تنقية البروتين من الطافي الذي تم جمعه. وقد أنتج نظام التعبير هذا عائداً عالياً من البروتينات السكرية، كما يتضح من نمط التعبير النموذجي لـ IgG one fc بعد عفن عابر لخلايا HK 2 93 F. وأدت التنقية بالألفة باستخدام عمود بروتيني لـ IgG one FC أو عمود نيكل لـ GFP الملحق بعلامة histamine مع FC gamma receptor three A إلى الحصول على بروتينات ذات نقاء عالٍ.

قام هذا النظام بالتعبير بكفاءة عن IgG one FC المخصب نظائرياً في طيف NMR ثنائي الأبعاد هذا، والذي يربط بين تردد الرنين لنوى الهيدروجين ونيتروجين الأميد المرتبط بها مباشرة. وقد لوحظت إشارات مشتتة جيداً لـ 15 ذرة. كما تم إنتاج أشكال سكرية مختلفة باستخدام خلايا HEK 2 93 F وHEK 2 93 s تحت ظروف استزراع مختلفة، كما أظهرت تحليلات مطيافية الكتلة بالتأين بالامتزاز الليزري بمساعدة المصفوفة.

احتوى IgG1 FC الذي تم التعبير عنه من خلايا HEK 293S على غليكانات كانت على شكل يحتوي على خمس وحدات من المانوز بالإضافة إلى بقيتين من N-acetyl glucosamine، ولم تحتوي على غليكانات fucose. أما المواد المعبر عنها من خلايا HEK 293F فقد كانت من أشكال bi-antennary من النوع المعقد مع وجود core fucose، وكانت في الغالب تحتوي على N-acetyl glucosamine طرفي أو نسبة صغيرة من الأشكال أحادية أو ثنائية السكر. وأظهرت إضافة مثبط لعملية الغليكانة (glycanation) في عملية تعبير أجريت باستخدام خلايا HEK 293F انخفاضًا بنسبة تزيد عن 90% في دمج الـ fucose. وبمجرد إتقان العملية، يمكن إكمال عملية عفن التحول المؤقت (transient transfection) في غضون 1.5 ساعة في اليوم الأول و15 دقيقة في اليوم الثاني. وبعد فترة تعبير تتراوح من أربعة إلى ستة أيام، يمكن حصاد المحلول الذي يحتوي على البروتين في غضون 15 دقيقة.

أخيراً، ستستغرق عملية تنقية البروتين حوالي 1.5 hours، وأثناء تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على مستنبت مستقر قبل عملية transfection، والقيام بعملية transfect للخلايا التي تنمو بنشاط، وإضافة DNA قبل إضافة PEI. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل التوصيف الوظيفي للبروتين باستخدام مجموعة من التقنيات الفيزيائية الحيوية من أجل سبر أغوار بنية ووظيفة البروتين السكري الذي تم التعبير عنه بعد تطويره.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف العلاقة بين البنية والنشاط لـ IgG والارتباط بالسكريات (glycosylation) في المختبر وفي الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وتنقية البروتينات السكرية باستخدام مزيجنا من خلايا K 2 93 F وناقل PZ N two.