رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد جينات مرشحة جديدة لاضطرابات تشوه الدماغ وتأكيد دورها المسبب بشكل مباشر داخل الجسم (in-vivo). يمكن لهذه الاستراتيجية أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا العصبية من خلال اكتشاف المسارات الجزيئية المرتبطة بنمو الدماغ والاعتلالات المرتبطة بها. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية في أنها ستساعد في اكتشاف جينات جديدة مرتبطة باضطرابات الدماغ وتطوير أدوات تشخيصية جديدة.

باستخدام هذا النهج، تمكنا من الكشف عن المساهمة الجوهرية لجين C6orf70 في إمراضية التغاير العُقيدي حول البطيني، وهو تشوه دماغي ناتج عن هجرة عصبية غير طبيعية. ستقوم فابيان شالر، وهي مهندسة من مختبرنا، بشرح الإجراء. قم بتجهيز جرذ حامل في اليوم embryonic day 15 (E15) لإجراء العملية كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ووفقاً للإرشادات المؤسسية والوطنية.

تأكد من تخدير الحيوان بشكل صحيح، ووضع مرهم العيون على العينين، وحلاقة منطقة البطن وتطهيرها جيداً. بعد استخدام مقص حاد لإجراء شق رأسي بطول سنتيمترين في الجلد وعضلة الخط الناصف للبطن الذيلي، قم بكشف أحد قرني الرحم بعناية من التجويف البطني. أضف محلول ملحي طبيعي مسخن مسبقاً إلى 37 درجة Celsius على شكل قطرات لترطيب الأجنة.

حافظ على رطوبة الرحم طوال فترة الإجراء. ولحقن الـ DNA، أمسك الجنين برفق بيد واحدة بحيث يكون الرأس سهل الوصول إليه. بعد ذلك، وباستخدام اليد الأخرى، أدخل بعناية أنبوبًا شعريًا زجاجيًا متصلاً بحاقن دقيق في البطين الجانبي الأيسر، والذي يقع على بعد 1 mm من الخط الناصف وعلى عمق يتراوح بين 2 إلى 3 mm.

استخدم المحقن الدقيق لحقن حوالي 1 µL من الـ DNA مع صبغة fast green للسماح بالمراقبة البصرية لعملية الحقن. ولإجراء التثقيب الكهربائي للـ DNA داخل الخلايا، قم أولاً بوضع قطرة من محلول الملح الطبيعي على سطح القطب الكهربائي الذي تبلغ أبعاده 3 × 7 mm. ثم ضع القطب الموجب على الجانب المحقون والقطب السالب على البطين الأيمن غير المحقون.

استخدم الدواسة التي يتم التحكم فيها بالقدم لإرسال خمس نبضات كهربائية بفواصل زمنية قدرها 950 millisecond. بعد عملية التثقيب الكهربائي، أعد القرن الرحمي إلى التجويف البطني وأضف محلول ملحي معقم للسماح للأجنة باتخاذ وضعية أكثر طبيعية ولتعويض فقدان السوائل أثناء العملية. أغلق جدار العضلات باستخدام غرز جراحية قابلة للامتصاص، ثم أغلق الجلد باستخدام غرزة بسيطة متقطعة.

قدم مسكنات الألم بعد الجراحة لمدة تصل إلى 48 ساعة أو وفقاً لما تحدده الإرشادات المؤسسية. أعد الجرذ إلى قفصه النظيف وراقبه حتى يفيق من التخدير. بعد تثبيت الأدمغة في 4%paraformaldehyde كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول، اغسلها في PBS لمدة 10 دقائق.

أثناء عملية الغسل، قم بتحضير 50 milliliters من 4% agar في PBS مع التأكد من أن درجة حرارة الأجاروز المذاب لا تتجاوز 50 degrees Celsius. صب الأجاروز في قوالب التثبيت البلاستيكية ثم ضع الأدمغة في الأجاروز. ضع الأدمغة المثبتة في درجة حرارة four degrees Celsius واترك الأجاروز يتبلمر لمدة ساعة واحدة على الأقل.

بعد بلمرة الأجاروز، قم بقص الأجاروز الزائد من حول الدماغ، ثم الصق الدماغ بلوحة قاعدة المقطاع الاهتزازي (vibratome) بحيث يكون محور الوصول الأمامي الخلفي للدماغ عمودياً على الشفرة. وبعد الانتظار لبضع دقائق حتى يجف الصمغ، ضع اللوحة التي تحتوي على الدماغ الملتصق داخل غرفة المقطاع الاهتزازي. املأ المقطاع الاهتزازي بمحلول PBS وابدأ في تقطيع مقاطع بسمك 100 micron.

بعد عملية التقطيع، انقل المقاطع إلى شرائح مجهرية وأزل السائل الزائد. ثم أضف بضع قطرات من وسط التثبيت وضع غطاءً شريحيًا فوق المقاطع. اتركها لتجف طوال الليل.

قم بتصوير المقاطع باستخدام تكبير 10x على مجهر كنفوكال ماسح بالليزر. ولتحليل الصور، قم أولاً بتحويل الصورة إلى صيغة 8-bit باستخدام برنامج مناسب للتحليل الكمي للصور. بعد ذلك، اختر خلية واحدة ممثلة ومفلورة وموجبة لـ GFP وقم بتحديد شكلها يدوياً من خلال النقر على estimate واستخدام أداة التحديد الحر لرسم حدود الخلية.

يقوم البرنامج تلقائياً بالاحتفاظ بقطر الخلية وعتبة الكثافة. انقر فوق "find cells" للسماح للبرنامج بتحديد مواقع الخلايا المنقولة في جميع أنحاء القشرة. ثم، إذا لزم الأمر، قم بإزالة النتائج الإيجابية الكاذبة يدوياً.

قم بتقسيم كامل سمك القشرة إلى ثماني مناطق اهتمام، يتم توحيدها في المقاطع الفردية، وذلك بالنقر على أداة المنطقة (region tool)، واختيار ثماني شرائط مناطق (region stripes)، حيث يتوافق الشريطان الأول والثامن مع المنطقة البطينية وأعلى الصفيحة القشرية على التوالي. بعد ذلك، انقر على تطبيق (apply) للسماح للبرنامج بحساب الموضع النسبي للخلايا المنقول إليها GFP في كامل القشرة. وأخيراً، انقر على حفظ الكمية (save quantification) لتصدير البيانات في ملف Excel لتحليلها.

حدد كل من التهجين الجينومي المقارن المصفوفي (Array CGH) وتسلسل الإكسوم الكامل جين C6orf70 كجين مرشح للاختلالات الجينية التنموية. وقد حدد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Quantitative PCR) أن هذا الجين، جنباً إلى جنب مع PHF10 و DLL1، يتم التعبير عنها في القشرة المخية للجرذ. تظهر الصور التالية مقاطع إكليلية تمثيلية للقشرة الحديثة لأدمغة جرذان في اليوم الجنيني E20 بعد 5 أيام من التثقيب الكهربائي إما ببنية البروتين الفلوري الأخضر بمفرده، أو مدمجاً مع shRNA يستهدف التسلسل المشفر لـ C6orf70، أو مع بنية عدم التطابق غير الفعالة نسبياً.

استُخدم تثبيط Filament A كضابط لخلل في الهجرة العصبية. أدى التثقيب الكهربائي داخل الرحم باستخدام shRNA الذي يستهدف C6orf70 أو Filament A إلى توقف الخلايا الموجبة لـ GFP داخل المنطقة البطينية كما تشير الأسهم البيضاء، بينما لم تغير الخلايا التي تعبر عن GFP وحده، أو بالتزامن مع بنية غير متطابقة، من الهجرة العصبية. عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراعاة مرحلة التخلق القشري التي ترغب في تحليلها، سواء كانت التكاثر العصبي، أو الهجرة، أو النضج.

لا تنسَ أن تعلم كيفية إجراء التثقيب الكهربائي في الرحم في دماغ الجنين للقوارض يتطلب فترة تدريب طويلة، ومهارات، وممارسة منتظمة.