رواية استراتيجية الجمع بين CGH الصفيف وتعاقب كل اكسومي وانهانسر في الرحم في القوارض لتحديد الجينات المسببة لتشوهات الدماغ

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد الجينات المرشحة الجديدة لاضطرابات تشوه الدماغ وتأكيد دورها المسبب بشكل مباشر في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الاستراتيجية في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب من خلال اكتشاف المسارات الجزيئية المرتبطة بنمو الدماغ والأمراض المرتبطة به. الميزة الرئيسية لهذه الاستراتيجية هي أنها ستساعد في اكتشاف جينات جديدة مرتبطة باضطرابات الدماغ وتطوير أدوات تشخيصية جديدة.

باستخدام هذا النهج ، يمكننا الكشف عن المساهمة الحاسمة لجين C6orf70 في التسبب في تغاير العقيدات حول البطين ، وهو تشوه في الدماغ ناتج عن هجرة الخلايا العصبية غير الطبيعية. سيوضح الإجراء فابيان شالر ، مهندس من مختبرنا. قم بإعداد فأر حامل E15 للإجراء كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ووفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية.

تأكد من تخدير بشكل صحيح ، ووضع مرهم العين على العينين ، وأن البطن قد حلق وتطهير بشكل صحيح. بعد استخدام مقص حاد لعمل شق رأسي بطول سنتيمترين في الجلد وعضلة خط الوسط الذيلية للبطن ، تكشف بعناية قرنا الرحميا واحدا من تجويف البطن. ضع محلول ملحي عادي مسخن مسبقا بزاوية 37 درجة مئوية بالتنقيط لترطيب الأجنة.

حافظ على رطوبة الرحم طوال العملية. لحقن الحمض النووي ، أمسك الجنين برفق بيد واحدة مع سهولة الوصول إلى الرأس. بعد ذلك ، باستخدام اليد الأخرى ، أدخل بعناية شعيرات دموية زجاجية متصلة بحاقن دقيق في البطين الجانبي الأيسر الذي يقع على بعد ملليمتر واحد من خط الوسط وعلى عمق اثنين إلى ثلاثة ملليمترات.

استخدم الحاقن الدقيق لحقن ما يقرب من ميكرولتر واحد من الحمض النووي باللون الأخضر السريع للسماح بالمراقبة البصرية للحقن. لتحويل الحمض النووي إلى الخلايا بالكهرباء ، قم أولا بإسقاط محلول ملحي طبيعي على سطح القطب الكهربائي المكون من ثلاثة في سبعة ملليمترات. ثم ضع القطب الموجب على الجانب المحقون والقطب السالب على البطين الأيمن غير المحقون.

استخدم دواسة التحكم في القدم لتوصيل خمس نبضات كهربائية على فترات 950 مللي ثانية. بعد التثقيب الكهربائي ، أعد قرن الرحم إلى تجويف البطن وأضف محلول ملحي معقم للسماح للأجنة بوضع الوضع بشكل طبيعي أكثر ومراعاة فقدان السوائل أثناء الجراحة. أغلق جدار العضلات بخيوط جراحية قابلة للامتصاص ، ثم الجلد باستخدام غرزة متقطعة بسيطة.

توفير تسكين ما بعد الجراحة لمدة تصل إلى 48 ساعة أو كما هو موضح في الإرشادات المؤسسية. أعد الجرذ إلى قفص منزله النظيف وراقبه حتى يخرج من التخدير. بعد إصلاح الأدمغة في 4٪ بارافورمالدهايد كما هو موضح في الجزء المكتوب من البروتوكول ، اغسلها في PBS لمدة 10 دقائق.

أثناء الغسيل ، قم بإعداد 50 مل من 4٪ أجار في PBS مع التأكد من أن درجة حرارة الاغاروز المذاب لا تتجاوز 50 درجة مئوية. صب الاغاروز في قوالب التضمين البلاستيكية ثم ضع الأدمغة في الاغاروز. ضع الأدمغة المدمجة عند أربع درجات مئوية واترك الاغاروز يتبلمر لمدة ساعة على الأقل.

بعد أن يقوم الاغاروز ببلمرة ، قم بتقليم الاغاروز الزائد من جميع أنحاء الدماغ ، ثم قم بلصق الدماغ على لوحة قاعدة الاهتزاز مع الوصول الخلفي الأمامي للدماغ بشكل عمودي على الشفرة. بعد الانتظار بضع دقائق حتى يجف الغراء ، ضع اللوحة مع الدماغ الملصق في غرفة الاهتزاز. املأ الاهتزاز ب PBS وابدأ في تقطيع أقسام بسمك 100 ميكرون.

بعد التقسيم ، انقل الأقسام إلى شرائح المجهر وقم بإزالة السوائل الزائدة. ثم أضف بضع قطرات من وسط التثبيت وضع زلة غطاء أعلى الأقسام. اتركيه ليجف طوال الليل.

قم بتصوير الأقسام باستخدام تكبير 10x على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر. لتحليل الصور ، قم أولا بتحويل الصورة إلى 8 بت باستخدام برنامج مناسب لتحليل الصور الكمي. ثم حدد خلية فلورسنت موجبة GFP تمثيلية واحدة وحدد شكلها يدويا بالنقر فوق التقدير واستخدام أداة الاختيار اليدوي الحر لرسم حدود الخلية.

يحتفظ البرنامج تلقائيا بقطر الخلية وعتبة شدتها. انقر فوق البحث عن الخلايا للسماح للبرنامج بتوطين الخلايا المنقولة في جميع أنحاء القشرة. ثم ، إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الإيجابيات الخاطئة يدويا.

قسم سمك القشرة بالكامل إلى ثمانية مجالات اهتمام ، تطبيعها في أقسام فردية ، من خلال النقر على أداة المنطقة ، وتحديد ثمانية خطوط منطقة ، حيث يتوافق الشريطان الأول والثامن مع المنطقة البطينية وأعلى الصفيحة القشرية على التوالي. بعد ذلك ، انقر فوق تطبيق للسماح للبرنامج بحساب الموضع النسبي للخلايا المنقولة GFP في القشرة بأكملها. أخيرا ، انقر فوق حفظ القياس الكمي لتصدير البيانات في ملف Excel للتحليل.

حدد Array CGH وتسلسل الإكسوم الكامل C6orf70 كجين مرشح لتشوهات الجينات التنموية. حدد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أن هذا الجين ، جنبا إلى جنب مع PHF10 و DLL1 يتم التعبير عنه في القشرة الدماغية للفئران. تظهر الصور التالية أقساما إكليلية قشرية حديثة تمثيلية لأدمغة الفئران E20 بعد 5 أيام من التثقيب الكهربائي إما باستخدام بناء بروتين الفلورسنت الأخضر بمفرده أو جنبا إلى جنب مع shRNA الذي يستهدف تسلسل ترميز C6orf70 أو مع بنية عدم التطابق النسبي غير الفعالة.

خيوط تم استخدام ضربة قاضية كتحكم في ضعف الهجرة العصبية. التثقيب الكهربائي داخل الرحم مع shRNA الذي يستهدف C6orf70 أو الفتيل A يؤدي إلى التوقف المستحث للخلايا الإيجابية ل GFP داخل منطقة البطين كما هو موضح في الأسهم البيضاء ، في حين أن الخلايا التي تعبر عن GFP وحدها ، أو بالاشتراك مع بنية عدم التطابق لم تغير هجرة الخلايا العصبية. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تضع في اعتبارك حالة التكوين القشري التي تريد تحليلها ، سواء كانت تكاثر الخلايا العصبية أو الهجرة أو النضج.

لا تنس أن تعلم إجراء التثقيب الكهربائي داخل الرحم في الدماغ الجنيني للقوارض يتطلب فترة تدريب طويلة ومهارات وممارسة منتظمة.