استخدام متعدد مقصورة الحيوي واحدة أنزيم فانتوم للدراسات وكلاء الرنين المغناطيسي Hyperpolarized

يتمثل الهدف العام من هذا الإجراء في قياس تحول البيروفات عالي الاستقطاب إلى لاكتات باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي أو MRI في بيئة نموذج محاكى (phantom) خاضعة للتحكم. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الاستقطاب، مثل قدرة النظام على اكتشاف التحول الكيميائي للبيروفات عن طريق الرنين المغناطيسي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن التحول الكيميائي للبيروفات يتم بشكل مشابه لعملية التمثيل الغذائي داخل الجسم الحي، ولكنه أكثر قابلية للتحكم والتكرار مما هو عليه في الأنظمة الحية.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو تشخيص السرطان لأن البيئة الوهمية تحاكي الارتفاع في تحويل البيروفات إلى لاكتات الشائع في معظم أنواع السرطانات. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول السرطان، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على تصوير عمليات أيضية أخرى مثل أيض القلب. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة بسبب القيود الزمنية القصيرة المتأصلة في الوسائط ذات الاستقطاب المفرط.

يُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الإذابة والقذف يصعب تعلمها نظراً لضرورة حدوثها بسرعة وبدقة تامة. في كوب عينة مخصص لنظام الاستقطاب النووي الديناميكي أو DNP، استخدم الماصة لنقل 0.3 µL من محلول gadoteridol و 13 mg من محلول pyruvic acid. قم بتحريك هذا الخليط لفترة وجيزة داخل كوب العينة باستخدام رأس الماصة.

ابدأ عملية إدخال العينة بالنقر على زر إدخال العينة (insert sample) في وحدة تحكم نظام DNP. في معالج العينات، اختر عينة عادية (normal sample) ثم انقر على التالي. مع الحفاظ على كوب العينة في وضع عمودي، ضع قضيب الإدخال برفق فوق الجزء العلوي من كوب العينة.

عند ظهور المطالبة، افتح نظام DNP وأدخل الكوب في حامل درجة الحرارة المتغيرة باستخدام قضيب الإدخال. اسحب المكبس الموجود في نهاية قضيب إدخال العينة لتحرير العينة داخل حامل درجة الحرارة المتغيرة. قم بإزالة قضيب إدخال العينة من النظام وانقر على زر "التالي" في لوحة تحكم نظام DNP.

ثم ابدأ عملية الاستقطاب بالنقر على زر استقطاب العينة (polarise sample) في وحدة تحكم نظام DNP. في برنامج RINMR، اكتب HYPERSENSENMR في برنامج مراقبة الاستقطاب. اضبط تكوين البناء (build up configuration) على القيمة one ثم اضغط enter.

بعد ذلك، انقر على "solid build up". بعد تحديد موقع واسم ملف الحفظ، اختر ملف الكربون 13 (carbon 13) من القائمة المنسدلة في وحدة تحكم نظام DNP. انقر على "التالي".

قم بتأشير المربع لتفعيل أخذ العينات أثناء مرحلة التراكم. اضبط وقت أخذ العينة على 300 ثانية ثم انقر على إنهاء. وأخيرًا، قم بقياس 3.85 غرام من وسط الذوبان، إما عن طريق الحجم باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر أو عن طريق الوزن باستخدام ميزان.

ضع النموذج في مركز المغناطيس مع ضمان سهولة الوصول إلى خطوط الحقن. تأكد من وجود وعاء لتجميع السائل الذي سيخرج عبر خط العادم. قم بتحضير خليط الإنزيم عالي النشاط عن طريق خلط 240 µL من محلول NADH و125 µL من محلول LDH و335 µL من المحلول المنظم.

احتفظ بالمحلول في سرنجة سعة 3 mL يمكن توصيلها بخط الحقن. بعد ذلك، قم بتحضير خليط الإنزيم منخفض النشاط عن طريق خلط 240 µL من محلول NADH و 75 µL من محلول LDH و 385 µL من المحلول المنظم. احتفظ بهذا الخليط في سرنجة منفصلة سعة 3 mL يمكن توصيلها بخط الحقن.

لإجراء التموضع الأولي، قم بتحميل مسح محدد للموقع (localizer scan) جديد. قم بتحريك ملف البروتون بشكل تذبذبي عبر تحديد Acq/Reco. اعرض منصة الضبط وقم بفتحها.

من لوحة الضبط، اختر Wobble Adjust وانقر على ppen. اضبط عرض المسح على 10 MHz وانقر على set up. بعد لحظات، يجب أن يظهر ضبط وتوليف ملفات البروتونات في نافذة الاستحواذ.

قم بعمل اهتزاز (Wobble) لملف الكربون عن طريق تغيير عنصر الملف إلى 13C أو العنصر الثاني، وضبط عرض المسح (sweep width) على 5 MHz. بعد لحظة، يجب أن يظهر ضبط التوليف والمطابقة (tuning and matching) لملفات الكربون في نافذة الاستحواذ، وإذا كانت مضبوطة بشكل صحيح، اضغط على stop. للعودة إلى التحكم في المسح (scan control)، اضغط على apply ثم back، وأخيرًا اضغط على continue لبدء المسح.

من الضروري إعداد عملية المسح في هذه الخطوة بشكل كامل قبل البدء في عملية الإذابة. فبمجرد بدء الإذابة، لا ينبغي إيقافها، وسيكون هناك وقت وجيز لتعديل بارامترات التسلسل قبل وصول البيروفات عالي الاستقطاب. قم بتحميل مسح تصوير طيفي مستوٍ بصداه الراديوي.

اضبط سُمك الشريحة على 30 millimeters لتغطية غرفة التفاعل بأكملها. اضبط وضع التشغيل على الكربون 13 من خلال تحديد علامة تبويب النظام وتغيير وضع التشغيل إلى 13C transmit receive. بمجرد أن يصل البيروفات إلى استقطاب أكبر من 90%، تصبح المحاليل والنموذج الوهمي (phantom) جاهزة ويكون المسح مهيأً.

انقر فوق زر تشغيل عملية الذوبان (run dissolution) في وحدة تحكم نظام DNP. عند ظهور المطالبة، حرك عصا الذوبان إلى وضع التشغيل واحقن وسيط الذوبان. أغلق نظام DNP وانقر فوق زر الانتهاء (finished) في وحدة تحكم نظام DNP.

من المهم أن يتم حقن البيروفات والإنزيم بسلاسة؛ حيث يضمن ذلك خلط مزيج الإنزيم بشكل صحيح وإيصاله إلى غرفة النموذج (phantom chamber) قبل اكتمال التحويل الكيميائي. عندما يقوم نظام DNP بتسليم مستخلص البيروفات عالي الاستقطاب، يتم حقن 500 micro-liters من محلول البيروفات في كل من سرنجات محلول تركيز الإنزيم المرتفع والمنخفض.

احقن كل سرنجة ببطء في خط الحقن. يمكن بدء المسح قبل الحقن أو بعده مباشرةً اعتماداً على بروتوكول المسح المستخدم. بعد اكتمال عملية الإذابة، قم بإعادة عصا الإذابة إلى وضع السكون عند ظهور المطالبة بذلك، ثم انقر فوق إنهاء.

تظهر هنا النتائج التمثيلية لتسلسل التصوير الطيفي بالصدى المستوي الإشعاعي. وتوضح صورة البيروفات إشارة بيروفات قوية في كلتا الحجرتين. بينما تظهر صورة اللاكتات إشارة لاكتات أضعف، ولكنها لا تزال متمركزة في الحجرتين.

يمكن استخدام نسبة الإشارة لكل من اللاكتات والبيروفات فائقي الاستقطاب لتقدير نشاط الإنزيم في كل غرفة. وتتطابق نسب الإشارة في كل غرفة مع نشاط الإنزيم الموجود. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ساعة واحدة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجهيز خليط النموذج الوهمي (phantom) وتسلسل التصوير قبل البدء في عملية الإذابة. وباتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام عوامل وإنزيمات أخرى مفرطة الاستقطاب للإجابة على أسئلة إضافية، مثل مدى كفاءة التسلسل في تصوير تفاعلات كيميائية أخرى. وتمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال التصوير بالرنين المغناطيسي مفرط الاستقطاب (hyperpolarized MRI) لاستكشاف أداء التسلسل باستخدام نماذج وهمية قابلة للتكرار.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير خليط إنزيمي لتسهيل تحويل البيروفات عالي الاستقطاب إلى لاكتات، وكيفية استقطاب البيروفات المخصب بالكربون 13 لغرض التصوير. تذكر أن العمل مع المجالات المغناطيسية القوية يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، ويجب دائمًا اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل التحكم في الدخول إلى غرفة الفحص.