تحريض الأم المناعي التنشيط في الفئران في مرحلة منتصف الحمل مع الفيروسية تقليد بولي (I: C)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز التنشيط المناعي الأمومي، أو MIA، في الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق للمحاكي الفيروسي poly في المرحلة الجنينية منتصف الحمل. يمكن لهذه الطريقة أن تساعدنا في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة العصبية، مثل كيفيةما يؤدي الخلل الوظيفي المناعي إلى اضطرابات في نمو الدماغ والسلوك. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها مصممة خصيصاً للباحثين المهتمين بدراسة MIA كعامل خطر بيئي للتوحد والفصام.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات، لأن الاختلافات الطفيفة في طريقة تحفيز MIA يمكن أن تغير بشكل كبير الاستجابة اللاحقة في النسل. لإعداد زوج تزاوج موقوت، ابدأ بوضع خمس إناث من الفئران في كل قفص بجوار بعضها البعض في أقفاص فئران قياسية لمزامنة دورات الشبق لديهن، واستخدم ثقابة الأذن لتمييز كل حيوان. قبل بدء الدورة المظلمة بساعتين إلى صفر ساعة، ضع إناث الفئران بواقع اثنتين في كل قفص، وقم بوزن وتسجيل وزن الجسم لكل فأرة على حدة، ثم أضف ذكراً واحداً في كل قفص يحتوي على أنثيين.

بعد مرور صفر إلى أربع ساعات من نهاية الدورة المظلمة، ارفع كل فأرة برفق من قاعدة الذيل، مع السماح للحيوان بالإمساك بشبكة القفص بالقوائم الأمامية، لتحديد وجود كتلة بيضاء في فتحة المهبل. إذا لم تكن السدادة ظاهرة، أدخل برفق طرف ماصة سعة 200 µL في فتحة المهبل. وتؤكد المقاومة الناتجة عن التخثر تشكّل السدادة.

يتم تجميع الفئران التي ظهرت لديها السدادة المهبلية في قفص جديد، حيث أن وجود السدادة المهبلية يؤكد فقط حدوث عملية الجماع. وفي الأيام الجنينية من 10.5 إلى 11.5، ترفع كل أنثى فأر ظهرت لديها السدادة من قاعدة الذيل، ويتم البحث عن انتفاخ في منطقة البطن، ثم توزن الفئران للتحقق من حدوث الحمل، وتوضع الحيوانات الحوامل في أقفاص نظيفة ومنفردة. يوزن مسحوق poly(I:C) في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

في اليوم الجنيني 12.5، أضف الحجم المناسب من كلوريد الصوديوم بتركيز 0.9% إلى الحجم المقابل من poly(I:C) في أنبوب مخروطي، ثم أغلق الغطاء. قم بدحرجة قطرة المحلول الملحي برفق فوق المسحوق حتى يصبح المحلول رائقاً. بعد ذلك، قم بطرد الأنبوب مركزياً، وانقل محلول poly(I:C) إلى أنبوب طرد مركزي صغير.

استخدم جهاز المطياف الضوئي لقياس نسبة الامتصاص عند 260 إلى 280 لمحلول poly(I:C). يجب أن تكون النسبة بين 1.54 و 1.82، كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بوزن الفأر الأول واملأ حقنة إنسولين سعة 0.3 milliliter بالحجم المحسوب المقابل من محلول poly(I:C).

بعد ذلك، احمل الفأر من ذيله وضعه على سطح القفص، وثبته من منطقة الرقبة (الجلد الخلفي). الآن، أدخل الإبرة بحيث يكون الجانب المائل للأعلى، في المنتصف بين الحلمتين العلويتين بزاوية 20 درجة تقريبًا بالنسبة للفأر، واحقن محلول poly(I:C). ثم أعد الفأر إلى القفص.

بعد حقن جميع الفئران، ضع الأقفاص في غرفة هادئة وقليلة الحركة لتجنب أي تأثيرات أخرى مربكة، وقم بوزن الفئران في صباح اليوم التالي. وقبل الاختبار السلوكي بثلاثة أيام على الأقل، قم بتغيير فرش الأقفاص للفئران البالغة من نسل التنشيط المناعي الأمومي (MIA) التي تتراوح أعمارها بين 8 إلى 12 أسبوعاً. وقبل الاختبار بـ 30 دقيقة، قم بتأقلم الفئران مع غرفة الاختبار.

لإجراء اختبار تثبيط الاستجابة المسبقة للنبضة، يتم تقييد الفئران في أسطوانات من البلكسي جلاس فوق مستشعر كهرضغطي. يتم تعويد الفأر على غرفة تثبيط الاستجابة المسبقة للنبضة لمدة خمس دقائق، مع ست تجارب من الضوضاء البيضاء بقوة 120 ديسيبل. بعد ذلك، تُعرض الفئران لمزيج عشوائي من الأصوات، كما هو موضح في الجدول، وتتم مقارنة النتائج باستجابة الجفل المرجعية، وذلك لتحديد تثبيط الاستجابة المسبقة للنبضة في حيوانات MIA.

لإجراء اختبار الحقل المفتوح، ضع فأراً في زاوية ساحة مربعة مفتوحة، تحتوي على منطقة مركزية محددة بأبعاد 17 × 17 سنتيمتر، وسجل مسار الفأر لمدة 10 دقائق عبر كاميرا مثبتة في السقف. بعد ذلك، قم بقياس عدد مرات دخول المنطقة المركزية، والوقت الذي قضاه الفأر فيها. أما بالنسبة لاختبار دفن الكرات الزجاجية، فقم بتكييف الفأر مع قفص الاختبار، الذي يحتوي على فرشة نظيفة من خشب الحور المضغوط بعمق 5 سنتيمتر، لمدة 10 دقائق، ثم أعد الفأر إلى قفصه الأصلي، ورتب بلطف 20 كرة زجاجية باللون الأزرق الداكن وبقطر 1.5 سنتيمتر في شبكة بأبعاد أربعة في خمسة داخل قفص الاختبار.

أعد الآن الفأر إلى قفص الاختبار لمدة 10 دقائق، ثم أعد الحيوان إلى القفص الأصلي، وقم بعدّ عدد الكرات الرخامية التي دُفنت خلال فترة الاختبار. يمكن أن يؤدي حقن Poly(I:C) في اليوم الجنيني 12.5 إلى استثارة استجابة التهابية حادة في المحور الجنيني والمشيمي والأمي، مما قد يؤدي إلى تأثير مزمن على تطور الدماغ والأنماط الظاهرية السلوكية. وبالفعل، يحفز poly(I:C) تعبيراً جينياً أعلى لـ Il6 في الطحال الأمي والمشيمة والدماغ الجنيني، بعد ثلاث ساعات من الحقن.

بشكل عام، تظهر الذرية البالغة التي تعرضت لـ MIA عدداً أقل من مرات دخول منطقة المركز، ومدة أقصر في منطقة المركز في اختبار الحقل المفتوح، وذلك مقارنة بالذرية البالغة المعالجة بالمحلول الملحي. كما تظهر الحيوانات المحقونة بـ poly(I:C) سلوكيات دفن أكثر تكراراً في اختبار دفن الكرات الزجاجية، وتثبيطاً أقل للاستجابة عند التنبيه المسبق. ويعد فقدان خلايا بوركينجي في الفصيحة السابعة للمخيخ علامة مميزة أخرى لذرية MIA، حيث لوحظ وجود عدد أقل من خلايا بوركينجي الموجبة للكالبينديم في الفصيحة السابعة للمخيخ في هذه الحيوانات، مقارنة بمجموعات الضبط المحقونة بالمحلول الملحي.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم إزعاج الفئران الحوامل بعد تحفيز MIA. بعد ذلك، يمكن تحفيز عوامل إضافية مثل الضغط النفسي في مرحلة ما بعد الولادة أو العدوى لدراسة المزيد من التفاعلات البيئية.