جنبا إلى جنب علم البصريات الوراثي وتجميد كسر طبق الاصل Immunolabeling لدراسة ترتيب المدخلات معين من الغلوتامات المستقبلات في اللوزة ماوس

الهدف من هذا الإجراء ، الذي يجمع بين علم البصريات الوراثي وتقنية الوسم المناعي المتماثل للكسر بالتجميد ، هو تحليل كثافة مستقبلات الغلوتامات المترابطة في نقاط الاشتباك العصبي في اللوزة الفأرية مع العناصر المشبكية المحددة قبل وبعد التلب. توفر قابلية التكرار العالية والتنوع لتقنية الملصقات المناعية المتماثلة للكسر المتجمد ، عند دمجها مع علم البصريات الوراثي ، نهجا قويا للغاية للتحليل المرتبط بالخصائص الهيكلية والوظيفية للمشابك العصبي. المزايا الرئيسية لهذا الإجراء هي: العرض المستوي للعناصر المشبكية قبل وبعد التشابك ، والتحليل الكمي للبروتينات في هذه المجالات الدقيقة المتخصصة.

يمكن تكييف تقنية مختلفة مع مجموعة متنوعة من الأنسجة المختلفة لدراسة توزيع وتنظيم بروتينات الغشاء المتكاملة. بشكل عام ، يمثل نهج FRIL البصري الوراثي المشترك هذا تحديا للمبتدئين بسبب المجموعة الكبيرة من الأجهزة والآلات المختلفة المطلوبة. يعد بدء التعديل بطريقة مختلفة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم بعض الخطوات الأخرى.

مثل تكسير العينات المجمدة وتكرارها لبدء هذا الإجراء ، قم بلصق كتلة إكليلية من دماغ الفأر على حامل القطاعة الاهتزازية. قم بتوجيه كتلة الأنسجة بحيث تواجه القشرة الجديدة الشفرة الاهتزازية. بعد ذلك ، قم بتقطيع الأقسام الإكليلية التي تحتوي على اللوزة الدماغية بسمك 140 ميكرومتر في صفر نقطة واحدة مولار ، PB مثلج بارد. واجمعها في طبق من ستة آبار في نفس العازلة.

تحت مجهر مجسم ، قم بقص منطقة الاهتمام من الشرائح ، في طبق بتري مغطى بالمطاط الصناعي السيليكوني ومليء بنقطة صفر واحدة مولار PB. بعد ذلك ، انقل الكتلة المشذبة إلى محلول الحماية بالتبريد ، واتركها طوال الليل عند ست درجات مئوية. في هذه الخطوة ، قم بإعداد حاملات النحاس لاستخدامها في المراحل المتتالية من إجراء FRIL ، عن طريق تلميعها بورقة من الجلد الوهمي كمزيل للتشويه. تحت المجهر ، قم بإرفاق حلقة من الشريط على الوجهين بالحامل النحاسي ، والذي سيكون بمثابة بئر تثبيت للكتلة المشذبة.

بعد ذلك ، ضع الكتلة المشذبة في فتحة الشريط على الوجهين باستخدام حلقة سلكية من البلاتين. قم بإزالة محلول التبريد الزائد باستخدام ورق ترشيح أو فرشاة. بعد ذلك ، قم بتغطية الناقل القابض بناقل آخر.

بحيث يتم وضع كتلة الأنسجة بين الناقلتين. لتجميد العينة ، أدخل شطيرة الناقل في حامل العينة. بعد ذلك ، أدخل حامل العينة في وحدة التجميد ذات الضغط العالي.

ابدأ دورة التجميد بالضغط على زر jet-auto ، وقم بإزالة حامل العينة على الفور ، واغمر الطرف في صندوق معزول بالنيتروجين السائل. بعد ذلك ، قم بإزالة شطيرة الناقل بعناية من حامل العينة ، وضعها في مادة مبردة مسبقا. قم بتخزين المواد المبردة التي تحتوي على الناقلات في خزان التبريد حتى النسخ المتماثل.

قبل إدخال مسدس شعاع الإلكترون ، قم بإزالة الدرع بلوحة العاكس. ضع مقياس الإعداد ، لتوسيط الفتيل ، في ظرف الكوليت من خلال غطاء الكاثود السفلي. بعد ذلك ، حرك الفتيل الجديد فوق المقياس ، حتى تثبت صفيحة الضغط نهايات الفتيل.

ثم قم بإزالة مقياس الإعداد وأدخل قضيب الكربون. قم بإصلاحه عن طريق شد ظرف كوليت حامل قضيب المبخر. التأكد من أن ارتفاع نهاية القضيب في منتصف الملف الثاني من الأسفل.

بعد ذلك ، استبدل لوحة العاكس ، وأدخل مسدس شعاع الإلكترون في وحدة كسر التجميد. في هذا الإجراء ، اضبط التيار والجهد للتبخر. بعد ذلك ، أدخل شطيرة الناقل المجمدة في طاولة النسخ المتماثلة المزدوجة في النيتروجين السائل.

بعد ذلك ، انقل الجدول المقلد المزدوج إلى سفينة ديوار ، وقم بإصلاحه في جهاز استقبال مرحلة العينة بزاوية 45 درجة. التقط الجدول المزدوج النسخة المتماثلة باستخدام مناور الجدول. أدخله في وحدة كسر التجميد على المرحلة الباردة ، وانتظر حوالي 20 دقيقة للسماح لدرجة حرارة الجدول المزدوج بالتكيف إلى سالب 115 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بكسر الأنسجة عن طريق تدوير العجلة عكس اتجاه عقارب الساعة يدويا ، والتي يتم توصيلها بالغطاء فوق طاولة النسخ المتماثلة المزدوجة. عندما يدور الكفن ، فإنه يجبر الطاولة ذات النسخة المتماثلة المزدوجة على الفتح ، مما يؤدي إلى كسر الأنسجة. يتم تطبيق طبقة من الكربون بزاوية 90 درجة على الوجوه المكسورة.

بعد ذلك ، قم بإزالة العينات المكررة من جدول النسخ المتماثلة المزدوجة ، وانقلها إلى صفيحة خزفية مكونة من 12 بئرا مملوءة ب TBS. باستخدام قضيب سلك حلقة بلاتينية ، قم بإزالة الأنسجة المكررة من حامل العينة. من أجل هضم SDS ، انقل نسخة طبق الأصل إلى قارورة زجاجية سعة أربعة ملليلتر مملوءة بمليلتر واحد من المخزن المؤقت للهضم SDS.

اتركه يهضم لمدة 18 ساعة عند 80 درجة مئوية مع الرج. لوضع العلامات المناعية ، اغسل النسخة المتماثلة لمدة 10 دقائق في مخزن مؤقت جديد لهضم SDS. ثم احتضنها بالأجسام المضادة الأولية والثانوية المخففة في 2٪ BSA-TBS ، في غرفة رطبة عند 15 درجة مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة.

بعد ذلك ، قم بتركيب النسخة المتماثلة على شبكة شريطية متوازية مطلية بالشكل البعيد مكونة من 100 سطر. صور النسخة المتماثلة بمجهر إلكتروني ناقل الحركة عند 80 أو 100 كيلو فولت. بعد ذلك ، احصل على الصور الرقمية من خلال كاميرا CCD.

عندما تكون غير متصلة بالإنترنت، ابحث عن المناطق المقابلة على الصورة من النسخة المتماثلة، باستخدام معالم مختلفة. بعد أربعة أسابيع من حقن AAV ، للتعبير عن Channelrhodopsin-2 في المجموعة النووية المهادية الخلفية ، يتم نقل Channelrhodopsin-2 بشكل فعال بشكل متقدم على طول المحاور المهادية للوصول إلى كتل الخلايا المتقاطعة اللوزة. يمكن التعرف على تخصص ما بعد التشابك المشابك الجلوتاماتيرجيك في نسخة طبق الأصل كمجموعة من الجسيمات داخل الغشاء على الوجه الإلكتروني لغشاء البلازما ، وغالبا ما يكون مصحوبا بوجه P لعنصره قبل المشبكي.

هنا ، تم تصور مستقبلات Channelrhodopsin-2 والغلوتامات باستخدام جزيئات الذهب بأحجام مختلفة مقترنة بالأجسام المضادة الثانوية. بسبب عدم وجود أدوات هيكلية أو جزيئية لاكتشاف ما إذا كان الغشاء بعد المشبكي ينتمي إلى الخلايا العصبية المقسمة على نفس النسخة المتماثلة. تم تصنيف النسخة المتماثلة المقابلة لمستقبلات المواد الأفيونية mu ، وهي علامة لهذه الخلايا العصبية.

كمثال على التحليل الكمي لكثافة مستقبلات الغلوتامات في هذه نقاط الاشتباك العصبي ، فيما يلي مخططات مبعثرة لعدد جزيئات الذهب لمستقبلات أمبا مقابل المنطقة المشبكية على العمود الفقري والتشعبات. مما يكشف عن ارتباط إيجابي في كلا الهيكلين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الخطوات الفردية مترابطة للغاية.

لذلك ، يمكن أن يؤدي الخطأ في إحدى الخطوات إلى تعريض الإجراء بأكمله للخطر. يسمح عرض جزء كبير من تخصصات غشاء البلازما على سطح ثنائي الأبعاد للنسخة المتماثلة بفحص التوزيع المكاني والاستمرارية الفيزيائية للجزيئات ذات الأهمية دون إعادة بناء شاقة وتستغرق وقتا طويلا لأقسام الأرتروفين التسلسلية. يمكن استخدام هذا النهج من قبل محققين آخرين لاكتساب نظرة ثاقبة حول علاقات البنية والوظيفة لمشابك معينة في الدوائر العصبية.

حيث يتم فك تشابك أصل المدخلات وطبيعة عناصر ما بعد المشبكي. أمر بالغ الأهمية ، لكنه إشكالي.