والأنسجة المشتركة 3D هندسيا

تتمثل الأهداف العامة لهذا النموذج المشترك لسرطان الرئة في المختبر / في السيليكو في دراسة حساسية العلاجات المستهدفة لسرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة والتنبؤ بفعالية المواد الجديدة. يسمح نظام النموذج ثلاثي الأبعاد هذا بمراقبة الاستجابات الخاصة بالخلايا للعلاجات المستهدفة أو التركيبات المباشرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التنبؤات التي يتم تغطيتها في السيليكو يمكن أن تسهل اختبار الأدوية قبل السريرية في بيئة أكثر صلة من الفسيولوجية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج كيانات الورم المختلفة ، حيث يمكن استخدامها لتحسين تنبؤات الاستجابة للأدوية بناء على خلفيات طفرية محددة. سيتم توضيح الإجراء ، فرانزيسكا شميت ، مساعد باحث ، من مختبرنا. لإنشاء ثقافة ديناميكية ، ابدأ بزراعة نموذج الورم في ظل ظروف مزرعة ثابتة ، في تاج خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، في حاضنة تقليدية.

بعد ثلاثة أيام ، قم بتجميع مفاعل حيوي معقم ، وأدخل سقالة غريمية بيولوجية بذرة في النظام بعد ذلك ، أضف 45 مل من RPMI ، مع استكمال الكمية المناسبة من FCS إلى قارورة وقم بتوصيل جهاز أخذ العينات الخالي من الإبرة بنظام الأنابيب بين المفاعل الحيوي وقارورة الوسط. ضع المفاعل الحيوي في الحاضنة وقم بتوصيله بالمضخة لزراعة نموذج الورم ، لمدة 14 يوما إضافية ، مع تدفق متوسط ثابت يبلغ ثلاثة ملليلتر في الدقيقة.

لعلاج نموذج الورم الثابت باستخدام Gefitinib ، في اليوم 11 من الثقافة في الحاضنة التقليدية ، استخدم أولا ماصة باستور لإزالة الوسط القديم من الآبار. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من RPMI المحضر حديثا ، مكملا ، FCS و Gefitinib ، إلى داخل كل تاج خلية و 1.5 مل إلى قاع كل بئر. لجمع عينات إليسا من مزرعة ديناميكية ، في الأيام من 11 إلى 14 من الثقافة ، قم بتوصيل المحقنة بجهاز أخذ العينات وإزالة مليلتر واحد من الوسط من نظام المفاعل الحيوي.

ثم قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم إجراء Elisa. لتحديد عدد النوى الموجبة Ki67 ، استخدم أولا مجهرا مقلوبا للحصول على خمس صور فلورية لتلوين DAPI وخمس صور فلورية تلطيخ Ki67 لثقافات ثنائية الأبعاد بتكبير 20 ضعفا لكل حالة ، من أقسام غير متداخلة من العينة. لحساب النوى الموجبة Ki67 يدويا ، افتح الصورة الناشئة في فيجي وحدد الإضافات وعداد الخلايا ، ثم انقر فوق تهيئة ، وحدد نوع العداد وانقر على كل نواة موجبة Ki67.

سيظهر عدد الخلايا التي تم النقر عليها بجوار نوع العداد المحدد. للعد التلقائي للخلايا لإجمالي عدد النوى في الصور ثنائية الأبعاد، ابدأ تشغيل مسجل الماكرو، وافتح صورة DAPI، وانقر فوق الصورة والنوع و8 بت، ثم انقر فوق تحسين التباين وقم بتعيين المعلمة المشبعة على واحدة وتطبيعها. لزيادة وضوح الصورة، اضبط القناع غير الحاد باستخدام نصف قطر واحد وقناع 60.

لربط الصورة ، انقر فوق عتبة تلقائية واختر طريقة Reny / Entropy مع كائنات بيضاء على خلفية سوداء. ثم ، انقر فوق الإضافات ، متبوعا ب BioVoxxel ، وميزة مستجمعات المياه غير المنتظمة ، مع نصف قطر تآكل خمسة لفصل الخلايا. انقر فوق تحليل وتحليل الجسيمات وتعيين الحجم إلى 02 ما لا نهاية وتحقق من التلخيص.

سيظهر عدد الخلايا في جدول الملخص كعدد. ثم انقر فوق إنشاء ، لحفظ الماكرو للسماح بالعد التلقائي للنوى ، في صور ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد أخرى. بعد استخدام قواعد البيانات المعروفة لإنشاء شبكة ورم ، افتح برنامج تحليل الشبكة المناسب ، وانقر فوق الملف والجديد ، وأدخل نماذج الورم jove.

انقر فوق موافق ، لإنشاء شبكة جديدة ، ثم انقر فوق مربع عن قرب شمال وموافق ، لتصور المستقبل في غشاء مزدوج. لتصور العقد كمستطيلات ، انقر فوق البروتين العام ، ثم EGFR ، ثم قم Ok.To تسمية العقد في الشبكة ، وانقر بزر الماوس الأيمن لتغيير اللون والشكل ، وقم بتعيين رموز ألوان العقدة كما هو موضح. لتصور معلمات القراءة كأشكال سداسية، حدد النمط الظاهري، وأدخل الانتشار، وانقر فوق موافق.

ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد تغيير اللون والشكل مرة أخرى لتعيين رمز اللون إلى 255 ، 204 ، 204. لتصور حواف تفاعلات العقدة، انقر فوق انتقال الحالة لأسهم التنشيط، وتثبيط أسهم التثبيط الخافتة. ثم ، انقر فوق ملف وحفظ باسم ، واحفظ شبكة الإشارات التي تم إنشاؤها ، مثل jove tumor models.xml.

لتحليل الحالة المستقرة لتوازن النظام ، افتح برنامج SQUAD ، وانقر فوق تحميل الشبكة ، وقم بتحميل ملف models. xml الورم jove. انقر ، قم بتشغيل التحليل.

لكتابة بروتوكول محاكاة ، انقر فوق خيارات متقدمة ، و pertubator ، ثم انقر فوق تحرير البروتوكول ، لمحاكاة مقاومة anit-EGFR. بعد ذلك ، انقر فوق الأنبوب وحدد الحالة الأولية القياسية تساوي الحالة المستقرة أربعة. انقر فوق إضافة ، لإضافة نبضة ثابتة جديدة ، ثم حدد معلمة الحالة واضبط الهدف على FLIP ، والوقت إلى الصفر ، والقيمة على 4.

انقر ، حسنا ، وقم بتعيين حالات c-MET و Gefitinib بنفس الطريقة. لتعيين قيمة حالة لعقدة EGFR النشطة، انقر فوق العقدة النشطة، ثم انقر فوق تحرير. اضبط الحالة على 8 وانقر فوق موافق.

انقر فوق موافق لحفظ البروتوكول. لعرض المنحنيات المحددة ، ضمن لوحة الخيارات ، حدد EGF-EGFR ، والنجمة EGF-EGFR ، والنجمة Mek ، والكاسباسيس ، و PI3K ، و Gegitinib ، وموت الخلايا المبرمج ، والانتشار ، ومثبط MEk ، ومثبط PI3K. ثم انقر فوق تهيئة وتشغيل لبدء محاكاة كاملة لاستجابة الأنظمة.

لمحاكاة علاج مثبط PI3K و Mek مدمج، انقر فوق تحرير البروتوكول. بعد ذلك ، باستخدام نفس معلمة العقدة كما هو موضح للتو ، انقر فوق الأنبوب ، متبوعا بإضافة ، لإضافة نبضة ثابتة جديدة. بعد ذلك ، حدد معلمة الحالة ، واضبط الهدف على مثبط PI3K ، والوقت إلى الصفر والقيمة إلى واحد ، وانقر فوق موافق.

انقر فوق إضافة ، مرة أخرى ، لإضافة نبضة ثابتة جديدة أخرى وتحت معلمة الحالة ، قم بتعيين الهدف إلى مثبط مجاهدين خلق ، واضبط الوقت على صفر والقيمة على واحد ، وانقر فوق موافق ، متبوعا بموافق مرة أخرى ، لحفظ البروتوكول. ضمن لوحة الخيارات، باستخدام نفس العقد للتمثيل الرسومي كما هو موضح للتو، انقر فوق تهيئة، وقم بتشغيله لبدء محاكاة كاملة لاستجابة الأنظمة. ثم ، لإنهاء المحاكاة ، انقر فوق إعادة تعيين.

نظام اختبار الورم ثلاثي الأبعاد هذا ، يسهل تحديد مؤشر الانتشار. والقياس الكمي لموت الخلايا المبرمج باستخدام M30 Elisa. في هذه التجربة التمثيلية ، على سبيل المثال ، استجابت الخلايا السرطانية HCC827 المتحولة EGFR فقط ، المحتضنة في ظل ظروف الثقافة الثابتة ، لتثبيط عامل نمو البشرة.

بواسطة مثبط التيروزين كيناز ، Gefitinib ، كما يتضح من الزيادة في موت الخلايا المبرمج الذي لوحظ في نظام نموذج الورم HCC827. هنا يتم عرض صور تمثيلية لنماذج الورم ثلاثية الأبعاد الثابتة ، مع أو بدون ، محفز الانتقال الظهاري الوسيط ، محاكاة TGF-beta-1. لاحظ الزيادة في تعبير الفيمنتين في مزارع الخلايا السرطانية المعالجة.

في ظل الظروف الديناميكية ، يمارس Gefitinib تأثيرا قويا على خلايا HCC827 المتحولة EGFR ، كما يتضح من انخفاض الهياكل الشبيهة بالأنسجة ، في وجود مثبط التيروزين كيناز ، مقارنة بالثقافة الخاضعة للرقابة غير المعالجة. في هذا الرسم البياني ، لوحظت محاكاة الدافع المعروف في الطفرة ، والتنشيط المشترك ل EGFR و c-MET ، وزيادة معدل الانتشار ، وانخفاض معدل موت الخلايا المبرمج في خلايا HCC827 ، بمرور الوقت ، مما يعكس مقاومة Gefitinib المستحثة التي ترتبط بتنشيط MEK و PI3K. في الواقع ، تؤدي نمذجة مثبطات PI3K و MEK مجتمعة إلى عكس تأثير المقاومة المضادة ل EGFR ، وتقليل الانتشار وتحريض موت الخلايا المبرمج.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل Western Blot أو للتحقيق في مسارات الإشارات النهائية. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا استخدام أنظمة الزراعة المشتركة مع أنواع مختلفة من الخلايا لتحليل الحديث المتبادل بين الخلايا المختلفة في البيئة الدقيقة للورم. تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تطوير الأدوية لاستكشاف فعالية الدواء في سيليكو.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التنبؤ بفعالية الدواء في مجموعات المرضى الطبقية ، من خلال محاكاة تغييرات الإشارات وتحليل استجابات النظام الناتجة في طفرات وخلفيات مختلفة.