بمساعدة الليزر تسليخ مجهري (لام) كأداة للالترانسكربتي التنميط من أنواع الخلايا الفردية

الهدف العام من هذا البروتوكول الخاص بـ LAM هو عزل خلايا نباتية محددة لإنتاج RNA عالي النزاهة للتحليل النسخي. وينصب التركيز على الخلايا التي يصعب الوصول إليها، مثل الخلايا البيضية، في أنواع boechera الجنسية واللاجنينية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال علم الوراثة التنموي للنباتات، مثل الأساس النسخي الذي يكمن وراء التكاثر الجنسي واللاجنسي للنباتات عن طريق البذور.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تنفيذ أنماط محددة معينة، مما يساعد في التغلب على تأثير حجب نسخ أنواع الخلايا النادرة عند تحليل أنسجة تصلب الشرايين. لبدء هذا الإجراء، استخدم محطة التثبيت (blocking station) لملء صينية موازنة بلاستيكية جديدة ومسخنة مسبقاً بشمع البارافين المذاب عند درجة حرارة 56 °C.

ارفع غطاء حمام البارافين والتقط كاسيت واحدة في كل مرة. انقل العينة إلى شمع البارافين السائل عند درجة حرارة 56 °C في صينية موازنة. تابع العمل بسرعة لتجنب تصلب الشمع حول العينة أثناء التعامل مع الكاسيت.

ثم، قم بتحديد موضع العينة وفقاً للتصميم التجريبي باستخدام إبرة تحضير. كرر هذه العملية حتى يتم نقل جميع العينات. ولتحضير مقاطع رقيقة لـ LAM، قم بإزالة شمع البارافين من العينة الموجودة في الصينية البلاستيكية باستخدام طاولة مضيئة.

استقطع قطعة من قالب الشمع التي تحتوي على العينة، مثل برعم أو زهرة، باستخدام شفرة حلاقة خالية من RNase. بعد ذلك، قم بصهر قطرة صغيرة من شمع البارافين على طرف ملعقة مختبرية (spatula). واستخدم الشمع الساخن لتثبيت القالب الذي يحتوي على العينة المغمورة فوق الدعامة.

قم بإزالة الشمع الزائد المحيط بالعينة باستخدام شفرة حلاقة، وتأكد من أن القالب ذو سطح مربع بحواف متوازية. بعد ذلك، اضبط لوحة التسخين على 42 درجة Celsius. ثم قم بتثبيت العينة في الميكروتوم بطريقة آمنة.

قم بتحضير قطاعات يبلغ سمكها سبعة ميكرومتر لخلايا المشيج الأنثوي الناضج لنبات boechera. بعد ذلك، انقل شرائط البارافين التي يتراوح طولها بين 10 إلى 15 سنتيمتر إلى صندوق بلاستيكي يحتوي على ورق مقوى أسود في القاع قبل وضعها على شرائح LAM. ولتحضير الشرائح لتقنية LAM، ضع من خمس إلى عشر شرائح ذات إطارات معدنية على لوح التسخين بحيث تكون الأسطح المستوية متجهة للأعلى.

ضع بواسطة الماصة من 1 إلى 2 ملليلتر من الماء الخالي من RNase على الجزء البلاستيكي من الشرائح. وباستخدام شفرة حلاقة، اقطع شرائط البارافين إلى قطع قصيرة يبلغ طولها حوالي 4 إلى 5 سنتيمتر، بحيث تكون طويلة بما يكفي لتغطية النوافذ البلاستيكية للشرائح.

بعد ذلك، استخدم ملقطاً وإبرة تحضير لوضع شرائح البارافين بشكل متوازٍ على النافذة البلاستيكية للشرائح. ارفع الشرائح بعناية من أحد طرفيها لإزالة الماء ثم أعدها إلى مكانها. غطِّ صفيحة التسخين بغطاء بلاستيكي دون لمس الشرائح، مع التأكد من أن الغطاء البلاستيكي يسمح بتبادل الهواء.

جفف الشرائح عند 42 درجة Celsius طوال الليل. وتحت غطاء كيميائي، قم بإزالة الشمع من الشرائح في الـ xylol مرتين لمدة 10 دقائق في كل مرة. تأكد من غمر الجزء البلاستيكي فقط من الشرائح، والحفاظ على الطرف العريض من الإطار المعدني لكل شريحة جافاً لتسهيل إزالتها.

اترك الشرائح لتجف لمدة 10 دقائق داخل خزانة المواد الكيميائية قبل إجراء مجهر المسح الليزري (LAM). في هذا الإجراء، قم بتشغيل جهاز الكمبيوتر والمجهر الخاص بـ LAM، ثم ابدأ بتشغيل البرنامج المسؤول عن توجيه المجهر والليزر.

قم بتشغيل صندوق التحكم في الليزر ثم شغّل الليزر بالضغط على الزر المقابل في صندوق التحكم. بعد ذلك، ضع غطاءً في حامل الأغطية. ضع شريحة LAM على شريحة زجاجية مخصصة للمجهر، وتأكد من أن السطح المستوي للشريحة الذي تتصل به الأنسجة يواجه الشريحة الزجاجية.

بعد ذلك، ضع الشريحة في الجهاز مع وجود الشريحة الزجاجية أسفلها. وأخيراً، ضع حامل الغطاء مع الغطاء في الجهاز. اختر العدسة الشيئية 4x.

في البرنامج، حرك الغطاء إلى الوضع العلوي. بعد ذلك، قم بإجراء مسح للشريحة. ابحث في الشريحة وحدد الهياكل ذات الأهمية.

حدد مواقعها واحفظها على الشريحة للسماح بالعودة إلى الموضع الدقيق في خطوة القطع. بعد ذلك، اختر الشيئية المناسبة. تحقق من موقع الليزر بالضغط على زر إطلاق الليزر مرة واحدة.

من الناحية المثالية، يتم ذلك في جزء من الغشاء الخالي من الأنسجة. مع وضع الغطاء في الوضع السفلي، استخدم أداة القلم اليدوي لتحديد حدود نوع الخلية أو النسيج المطلوب. على سبيل المثال، خلية البيضة.

قم بتشريحها باستخدام الليزر عبر الضغط على Cut. ومن أجل عزل الخلايا الفردية، من الضروري تحديدها بوضوح في المقاطع الصحيحة. كما يجب أن يكون قطر الخلايا 8 µm على الأقل لجعل تحليل النسخ الخاص بنوع الخلية ممكناً.

يرجى ملاحظة أنه يجب تكرار عملية التقطيع إذا لم يتم تشريح الحدود المحيطة بالخلية بالكامل، وهو ما يمكن رؤيته عادةً على الشاشة. وفي هذه الحالة، يُنصح بضبط البرنامج ليتولى تشغيل تكرارين من التقطيع تلقائياً كإجراء قياسي. بعد ذلك، ارفع الغطاء وانتقل إلى موضع الحفظ التالي الذي يحتوي على بنية ذات أهمية، وقم بتشريح مقطع الخلية التالي حتى يتم جمع جميع الخلايا المستهدفة من الشريحة الواحدة.

تأكد من وضع الغطاء بطريقة تضمن التصاق القسم الجديد بموضع فارغ على الغطاء. بعد عزل أنواع الخلايا المستهدفة من جميع الشرائح، قم بإزالة الشريحة من الجهاز. ضع حامل الغطاء في الموضع السفلي وافحص سطح الغطاء بصرياً.

واستخدم الشيئية 4x لاستبعاد الملوثات غير النوعية في العينة. ثم أغلق الغطاء. وقم بتجميد المقاطع الجافة عند درجة حرارة -80 °C حتى حين استخدامها.

إليك الرسم التخطيطي للمشيج الأنثوي الناضج. هذه مقاطع رقيقة عبر البويضات التي تحتوي على مشيجات أنثوية في نبات boechera divaricarpa، حيث يمكن تحديد الخلايا البيضية بوضوح نظراً للمورفولوجيا المميزة للمشيج الأنثوي. وقد تم الحصول على جودة RNA مماثلة عند تحليلها من مقاطع الخلايا البيضية مقارنة بمساحات الأنسجة الأكبر التي تم جمعها من الشرائح نفسها كعينات ضابطة.

كانت جودة الـ RNA التي تم الحصول عليها مناسبة لتسلسل الـ RNA الخاص بنوع الخلايا، مما أدى إلى تحديد 236 جينًا يتم التعبير عنها في الخلية البيضية الأبوميكتية ولكن ليس في الخلية المركزية الأبوميكتية، أو الخلية المساعدة، أو الخلية الأولية الأبوميكتية. ولا في خلايا المشيج الأنثوي الجنسي الناضج لنبات arabidopsis thaliana. ويمكن تحليل أنواع أخرى من الخلايا والأنسجة من أنواع مختلفة للإجابة على أسئلة إضافية في علم الوراثة التنموي.

مثل الأساس الجزيئي للبصم الجيني في السويداء والأجنة لبذور النباتات. وبعد تطويرها، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الوراثة التطورية وتكاثر النباتات لاستكشاف الأساس النسخي للتكاثر العذري في جنس Boechera. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية الحصول على RNA عالي الجودة لتحليلات النسخ النوعية لأنواع الخلايا باستخدام التشريح الدقيق بمساعدة الليزر.