باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين
أبريل 10, 2016
الهدف العام من هذا البروتوكول التجريبي هو تصوير تطور العين لجنين الزرد في مجهر الورقة الضوئية ومعالجة مجموعة البيانات متعددة المشاهدات المكتسبة في Figi عبر المكون الإضافي لتطبيق إعادة البناء متعدد الرؤية. يمكن أن تساعدك هذه الطريقة على فهم الأحداث المورفوجينية في نمو. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يمكنك ملاحظة الأحداث المورفولوجية في الجنين النامي في اللباقة بدقة مكانية وزمانية عالية.
تتمثل الميزة الرئيسية للفحص المجهري للورقة الضوئية في السمية الضوئية المنخفضة للطريقة ، وتوقيت الاستحواذ السريع الذي يمكنك من خلاله تصوير العينة وأنه يمكنك تصوير العينة من زوايا مختلفة ، ما يسمى بالمناظر. يسمح لنا التقاط العينة من طرق عرض مختلفة بالتغلب على تدهور الإشارة والمحور المحدد. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الصور المختلفة وتسجيلها باستخدام كريات مجهرية فلورية حول العينة.
يمكننا إعادة بناء الحجم ثلاثي الأبعاد للوصول إلى الدقة المتناحية. على الرغم من أننا نوضح استخدام الفحص المجهري الدقيق للصفائح الخفيفة لتطوير عين الزرد ، إلا أنه يمكن استخدام هذه الطريقة أيضا للإجابة على أسئلة مختلفة في علم الأحياء التنموي وعلم الأعصاب باستخدام كائنات نموذجية مختلفة. للبدء ، قم بربط هدف الكشف في المجهر مع الحفاظ على الأهداف المضيئة مغطاة.
بعد ذلك ، قم بفك غطاء الأهداف وحرك غرفة العينة بعناية في المجهر. قم بتأمين الغرفة عن طريق شد المسمار. ثم قم بتوصيل مسبار درجة الحرارة وكتلة بلتيير بالمجهر.
الأنبوبان اللذان يعملان على تدوير سائل التبريد لكتلة بلتيير متوافقان مع كلا الموصلين ويمكنهما العمل في أي من الاتجاهين. بعد ذلك ، استخدم حقنة لتحميل الغرفة من خلال المحقنة بمحلول يصل إلى الحافة العلوية لنوافذ الغرفة والتحقق من وجود تسريبات. الآن ، قم بتشغيل المجهر والكمبيوتر والحضانة.
ابدأ تشغيل برنامج تشغيل المجهر واضبط درجة حرارة الحضانة على 28.5 درجة مئوية. بينما تتطلب درجة الحرارة لمدة ساعة ، قم بإعداد العينة. ابدأ بتحضير الاغاروز.
قم بإذابة مليلتر واحد محضر من 1٪ نقطة انصهار منخفضة agarose في E ثلاثة متوسطات عند 70 درجة مئوية. بعد حوالي 15 دقيقة ، انقل 600 ميكرولتر من الاغاروز المنصهر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وأضف 250 ميكرولتر من E ثلاثة متوسطات ، و 50 ميكرولتر من 0.4٪ MS 222 ، و 25 ميكرولتر من محلول مخزون حبة الفلورسنت الدوامة. ضع الأنبوب في كتلة تسخين عند حوالي 39 درجة مئوية للسماح للأغروز بالاقتراب من نقطة التبلور.
بعد ذلك ، ادفع الغطاسات المائلة من التفلون إلى أسفل الشعيرات الدموية الزجاجية ذات القطر الداخلي المليمتر الواحد. تحضير خمسة من هؤلاء. الآن ، قم بدوامة خليط الاغاروز لفترة وجيزة ثم انقل خمسة أجنة بأقل كمية من السائل فيه.
ثم أدخل الشعيرات الدموية واستنشق رأس جنين واحد أولا. يجب أن يدخل الرأس قبل الذيل ولا يمكن أن يكون هناك أي فقاعات هواء. ارسم محلولا كافيا بحيث يكون هناك حوالي سنتيمترين من الاغاروز فوق الجنين وسنتيمتر واحد من الاغاروز تحته.
ارسم جنينا واحدا في كل شعيرات دموية قبل المتابعة. تتطلب هذه الخطوة بعض الممارسة لإتقانها. استعد لذلك باستخدام أجنة غير قيمة.
عندما يتجمد الاغاروز تماما ، قم بتخزين العينات في E ثلاثة وسط عن طريق دعم الشعيرات الدموية إلى جدار دورق مع البلاستيسين مع الفتحة السفلية في المحلول. الآن قم بتجميع حامل العينة. أولا ، أدخل غلامين بلاستيكيين بالحجم المناسب ضد بعضهما البعض في الساق.
يجب أن تكون الشقوق الموجودة على الأكمام متجهة للخارج. بعد ذلك ، قم بإرفاق المسمار المشبك. وأدخل الشعيرات الدموية من خلال الحامل حتى يصبح شريط اللون الأسود مرئيا على الجانب الآخر.
تجنب لمس المكبس. ثم شد المسمار المشبك. بعد ذلك ، ادفع سنتيمترا من الاغاروز من الشعيرات الدموية وقم بقصها.
ثم أدخل الجذع في قرص حامل العينة. قبل تحميل نموذج القرص، تحقق من أن المرحلة في أعلى موضع في برنامج التحكم. بعد ذلك ، استخدم قضبان التوجيه لتحريك الحامل وأخذ عينة في المجهر.
الآن ، قم بتصوير العينة المختارة كما هو موضح في بروتوكول النص. تتم معالجة البيانات في Figi. إنه توزيع ImageJ.
قبل البدء ، يجب تحديث Figi. احفظ مجموعة بيانات الصورة المكتسبة في مجلد واحد. سيتم حفظ الملفات الوسيطة لمعالجة الصور في نفس المجلد.
الآن ، ابدأ تطبيق إعادة بناء العرض المتعدد. ثم حدد مجموعة بيانات جديدة. حدد الخيار Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats وقم بإنشاء اسم لملف بيانات الإخراج.
ثم حدد أول ملف CZI لمجموعة البيانات. سيتم تحميل البيانات الوصفية تلقائيا. في البيانات الوصفية للصورة ، تحقق جيدا من ضبط عدد الزوايا والقنوات والإضاءات وحجم الفوكسل بشكل صحيح.
عند الضغط على موافق ، نافذة سجل ، تفتح نافذة مستكشف إعداد العرض ، ونافذة وحدة التحكم. يوفر مستكشف إعداد طريقة العرض واجهة سهلة الاستخدام. حدد الملفات التي تحتاج إلى معالجة واضغط على زر الماوس الأيمن.
سيتم فتح نافذة جديدة تعرض خطوات المعالجة المختلفة أثناء تنفيذها. في الزاوية اليمنى العليا توجد أزرار المعلومات والحفظ. يعرض Info ملخصا لمحتوى ملف البيانات المحفوظة وسيؤدي الضغط على Save إلى حفظ نتائج المعالجة.
لايقوم البرنامج بحفظ نتائج خطوات المعالجة بخلاف ذلك. لإعادة حفظ مجموعة البيانات بأكملها ، أولا ، حدد جميع الملفات بالضغط على Ctrl + A وباستخدام النقر بزر الماوس الأيمن. ثم حدد إعادة حفظ مجموعة البيانات وAs HDF5.
يجب بعد ذلك تحديد تأكيد إجراء إعادة الحفظ. بعد بضع دقائق ، لكل نقطة زمنية ، سيشير البرنامج إلى اكتمال إعادة الحفظ. ثم تابع الكشف عن نقاط الاهتمام في البيانات.
حدد جميع النقاط الزمنية بالضغط على Ctrl + A والنقر بزر الماوس الأيمن. للتحديد، اكتشف نقاط الاهتمام. من الخيارات ، حدد فرق الغوس.
وحدد عينة من الصور قبل التجزئة. في النافذة التالية ، اختر إعدادات الكشف. من خيارات ترجمة البكسل الفرعي، حدد ملاءمة تربيعية ثلاثية الأبعاد.
ثم ، في مواصفات نقطة الاهتمام ، حدد تفاعلي. بالنسبة لخيار XY للعينة السفلية، حدد مطابقة دقة Z. وبالنسبة للعينة Z ، حدد 1x.
بعد ذلك، قم بتنفيذ العملية عن طريق تحديد خيار الحساب على وحدة المعالجة المركزية Java. من النافذة المنبثقة ، حدد طريقة عرض واحدة لاختبار المعلمات. بمجرد تحميل العرض ، اضبط السطوع والتباين بالضغط على Ctrl + Shift + C على لوحة المفاتيح.
أيضا ، للكشف عن الخرزة ، قم بتبديل البحث عن خيار الحد الأقصى الأخضر. لاحظ الآن التجزئة حيث حلقات خضراء حول الاكتشافات. اضبط قيم الفرق في gaussien لمعلمات سيجما واحدة والعتبة لتقسيم الخرزات على النحو الأمثل مع الحد الأدنى من الإيجابيات الخاطئة.
يجب اكتشاف كل حبة مرة واحدة فقط. بعد تحديد المعلمات المثلى ، اضغط على تم. بعد تحميل الكمبيوتر, كل عرض فردي للنقطة الزمنية وتقسيم الخرز, يقوم البرنامج بإخراج ملف سجل مع عدد الخرزات التي اكتشفها في كل عرض.
يجب أن يكون هناك ما بين 600 وعدة آلاف من الخرزات لكل عرض. خلاف ذلك ، تحتاج معلمات الكشف إلى التغيير والتبديل. هذه عملية صعبة.
نادرا ما يكون هرم الكشف دقيقا في المحاولة الأولى ويمكن أن تختلف عمليات إعادة الضبط بين النقاط الزمنية لفيلم واحد. سيساعد الاسترخاء الطازج باكتشاف جميع الخرزات الحقيقية والسماح بمزيد من الإيجابيات الكاذبة. إذا لم تنجح أي مجموعة من الهرم ، فيجب الحصول على مجموعة بيانات جديدة باستخدام حبات فلورية مختلفة.
تابع الآن تسجيل الاكتشافات وإجراء فك عرض متعدد من المكدس. LSFM هي طريقة مثالية لتصوير العمليات التنموية على نطاقات متعددة من الهياكل بين الخلايا إلى الخلايا والأنسجة بأكملها لفترات طويلة من الزمن. يمكن التقاط الأحداث بين الخلايا السريعة جدا بدقة عالية ، مثل نمو الأنابيب الدقيقة في الخلايا السلفية العصبية.
من فيلم عرض واحد ، يمكن القياس الكمي لنمو الأنابيب الدقيقة. يمكن متابعة الهياكل داخل الخلايا على مدى عدة ساعات مثل الجسيم المركزي داخل الخلايا العقدية الشبكية. يمكن استخراج سلوك الخلية المفردة من صور الأنسجة الكاملة مثل الموقع العابر للخلية العقدية عبر شبكية العين.
ينشئ فك الالتفاف متعدد المشاهدات مكدس Z متناحي واحد من خلال الجمع بين عدة طرق عرض مختلفة باستخدام وظيفة انتشار النقاط. يوفر هذا صورا محسنة بشكل كبير مقارنة بطرق العرض الفردية أو الاندماج المتوسط المرجح. على سبيل المثال ، يمكن دراسة تحويل الحويصلة البصرية إلى كوب بصري من شرائح بصرية في اتجاهات مختلفة من خلال مجموعة البيانات المعروضة.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن جودة الصورة الجيدة بشكل عام ، حتى في أعماق الجنين واضحة. كما هو الحال عند عرض تشكل الكوب البصري. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تركيب صورة أجنة الزرد في مجهر ورقة ضوئي.
وكيفية معالجة مجموعات البيانات متعددة المشاهدات في Figi. بمجرد إتقانها ، سيستغرق الأمر حوالي ساعتين لبدء تجربة الفاصل الزمني على مجهر الألواح الضوئية. سيستغرق تحليل البيانات اللاحق وقتا أطول بكثير.
قد يكون من المفيد استخدام مجموعة كمبيوتر لهذه المهمة. يمكن العثور على المزيد من النصائح العملية ونصائح حل المشكلات وروابط لموارد أخرى في بروتوكول النص. يجب أن تكون هناك سعة تخزين كافية وخطة أنابيب معالجة بيانات واضحة متاحة قبل التجربة.
إذا كانت لديك أي مشاكل أو أسئلة أو طلبات مستقبلية ، فيرجى الرجوع إلى موقع الويب الخاص بالميزات أو مشكلات الملفات في مستودعات github المعنية.
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً لتصوير تطور عين الأسماك الزردية باستخدام الفحص المجهري الفلوري بطبقة الضوء. تتيح الطريقة تصويرًا عالي الدقة للجنين الحي، مما يمكن الباحثين من مراقبة الأحداث المورفولوجية في الوقت الحقيقي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
الخلفية
- يوفر الفحص المجهري الفلوري بطبقة الضوء سمية ضوئية منخفضة وأوقات استحواذ سريعة.
- تتيح هذه التقنية التصوير من زوايا متعددة لتعزيز جودة البيانات.
- يمكن تطبيقها على كائنات نموذجية مختلفة بخلاف الأسماك الزردية.
هدف الدراسة
- تصور وتحليل تطور عين أجنة الأسماك الزردية.
- تبيان خط أنابيب لمعالجة مجموعات البيانات متعددة الزوايا.
- تسهيل فهم العمليات التنموية في الأجنة.
الطرق المستخدمة
- تحضير أجنة الأسماك الزردية في الأغاروز لتصويرها.
- استخدام مجهر طبقة الضوء لالتقاط الصور.
- معالجة البيانات باستخدام Figi وتطبيق إعادة البناء متعدد الزوايا.
- تسجيل الصور باستخدام الكريات الفلورية.
النتائج الرئيسية
- تصوير ناجح لتطور عين الأسماك الزردية بدقة مكانية وزمانية عالية.
- إعادة بناء أحجام ثلاثية الأبعاد من مجموعات البيانات متعددة الزوايا.
- تبيان تعددية استخدامات الطريقة لأسئلة مختلفة في علم الأحياء التنموي.
الاستنتاجات
- الفحص المجهري بطبقة الضوء هو أداة قوية لدراسة التطور الجنيني.
- يمكن تكييف البروتوكول لكائنات نموذجية مختلفة وأسئلة بحثية.
- تعزز هذه الطريقة فهمنا للأحداث المورفولوجية في الأجنة الحية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Light sheet fluorescence microscopy enables high-resolution, low-phototoxicity imaging of live zebrafish embryos, supporting real-time observation of morphogenetic events in developmental biology. This capability enhances target validation by providing quantitative, multi-scale phenotypic data from intact organisms, reducing reliance on endpoint assays. The method supports mechanistic de-risking in early discovery by allowing longitudinal tracking of cellular behaviors and tissue dynamics relevant to disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through visualization of morphogenetic processes in developing tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by linking genetic or pharmacological perturbations to phenotypic outcomes in vivo.
- Predictive Value: Improves confidence in target relevance by capturing dynamic, spatially resolved biological responses over time.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multi-view datasets suitable for high-content analysis of developmental phenotypes.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible imaging workflows using commercial light sheet microscopes and open-source processing pipelines.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening and target engagement studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides disease-relevant system insights by imaging conserved developmental pathways across model organisms.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of intracellular structures and cell behaviors over extended periods, supporting preclinical validation of target modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by enabling longitudinal assessment of therapeutic effects on tissue morphogenesis and cellular dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic screening in vertebrate models, with outputs feeding into lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking through high-resolution, time-lapse imaging of developing tissues.
- Screening: Enables assay readiness via standardized embryo mounting, multi-view acquisition, and reproducible data processing using Fiji-based plugins.
- Analytics: Generates quantitative 3D reconstructions and isotropic voxel data that facilitate comparison of structural and dynamic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by imaging conserved processes such as optic cup formation and retinal ganglion cell migration relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable imaging platform adaptable to diverse developmental biology and neuroscience questions beyond zebrafish eye development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in developmental phenotypes through direct visualization.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility via defined mounting, imaging, and multiview registration protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of phenotypic liabilities, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing longitudinal, quantitative readouts on target modulation in intact developing systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, agarose embedding, and fluorescent sample preparation.
- Dependent on access to commercial light sheet microscopes and computational resources for terabyte-scale multiview data processing.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters, file naming, and metadata handling for reproducible multi-view reconstruction.
- Involves adaptation considerations when transferring the protocol to other model organisms or tissue types due to variations in size, opacity, and developmental timing.
- Limited by storage and processing demands; requires advance planning for data management and pipeline scalability.
