سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور تحلل تعداد الحالة المستقرة لبروتين معين في خميرة Saccharomyces cerevisiae. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد المتطلبات الجينية والتأثيرات البيئية على تحلل البروتين محل الدراسة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في عدم الحاجة إلى النظائر المشعة أو خطوات الترسيب المناعي الطويلة، على عكس تقنيات النبض والمطاردة (pulse-chase)، والتي تُستخدم أيضاً لتصور تحلل البروتين.

يمكن استخدام هذا الإجراء لتحليل بروتين خميرة داخلي المنشأ أو بروتين يتم التعبير عنه من بلازميد. وبالنسبة للحالة الأخيرة، يتم تحويل سلالة الخميرة باستخدام بلازميد يشفر البروتين المراد دراسته وفقاً لبروتوكول تحويل الخميرة القياسي. ثم يتم تلقيح الخميرة في 5 milliliters من الوسط المناسب.

تُحضن المزارع طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع التدوير. وفي صباح اليوم التالي، يتم قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر، أو OD600، لكل مزرعة من المزارع المحضنة طوال الليل. ثم تُخفف المزارع لتصل قيمة OD600 إلى 0.2 في 15 ملليلتر من الوسط الغذائي الطازج.

يتم التحضين عند درجة حرارة 30 درجة مئوية مع الرج حتى تصل الخلايا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط. وأثناء نمو خلايا الخميرة، يتم التحضير لإجراء عملية تتبع السيكلوهكسيميد (cycloheximide chase). اضبط كتلة تسخين (heat block) يمكنها استيعاب أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلتر على درجة حرارة 30 درجة مئوية لتحضين الخلايا في وجود السيكلوهكسيميد.

لضمان توزيع الحرارة بكفاءة على المستنبتات، أضف الماء إلى كل بئر من آبار الكتلة الحرارية بحيث يؤدي وضع أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter إلى ارتفاع مستوى الماء ليصل إلى حافة البئر دون أن يفيض. اضبط كتلة حرارية ثانية يمكنها استيعاب أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 milliliter على درجة حرارة 95 degrees Celsius لتمسخ البروتين بعد تحلل الخلايا. قم بتدفئة وسط نمو جديد مسبقاً ليصل إلى 30 degrees Celsius.

يلزم 1.1 milliliters من الوسط لكل نقطة زمنية لكل مزرعة سيتم تحليلها. أضف 50 microliters من 20x Stop Mix إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مصنفة مسبقاً. جهز أنبوباً واحداً لكل نقطة زمنية لكل مزرعة سيتم تحليلها.

ضع الأنابيب على الثلج. وعندما تصل خلايا الخميرة إلى مرحلة النمو اللوغاريتمية المتوسطة، اجمع 2.5 وحدة OD600 من كل مزرعة لكل نقطة زمنية سيتم تحليلها. وتعادل وحدة OD600 واحدة كمية الخميرة الموجودة في مليلتر واحد من المزرعة عند قيمة OD600 تبلغ 1.0.

قم بطرد الخلايا المجمعة مركزياً في أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter عند 3,000 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. تخلص من السائل الطافي. ثم أعد تعليق كل كتلة خلوية في 1 milliliter من وسط نمو طازج بدرجة حرارة 30 °C لكل 2.5 وحدة OD600 من الخلايا.

قبل البدء في عملية تتبع السيكلوهكسيميد (cycloheximide chase)، قم بموازنة معلقات خلايا الخميرة عن طريق تحضينها في كتلة تسخين عند درجة حرارة 30 درجة Celsius لمدة خمس دقائق. إن الجانب الأكثر صعوبة في هذا الإجراء هو توقيت إضافة السيكلوهكسيميد وجمع الخلايا لكل عينة. ولضمان النجاح، نقوم بوضع جدول زمني لإضافة السيكلوهكسيميد وجمع الخلايا والالتزام به بدقة.

لبدء عملية تتبع السيكلوهكسيميد، اضغط على "Start" في المؤقت. أضف السيكلوهكسيميد بسرعة وبحذر إلى معلق خلايا الخميرة الأول ليصل إلى تركيز نهائي قدره 250 µg/mL، ثم استخدم جهاز الـ vortex لفترة وجيزة للمزج. انقل فوراً 950 µL، أو ما يعادل 2.4 OD600 تقريباً، من معلق خلايا الخميرة المضاف إليه السيكلوهكسيميد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مُصنف مسبقاً يحتوي على 50 µL من محلول Stop Mix بتركيز 20x المبرد بالثلج.

قم برج أنبوب جهاز الطرد المركزي الدقيق باستخدام جهاز الرج (Vortex) وضعه على الثلج حتى يتم جمع جميع العينات. ابدأ عملية تتبع السيكلوهكسيميد (cycloheximide chase) كما هو موضح لكل من معلقات خلايا الخميرة المتبقية على فترات زمنية منتظمة. وعند كل نقطة زمنية لاحقة، قم برج معلقات خلايا الخميرة باستخدام جهاز الرج، وانقل 950 microliters إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مُعلمة تحتوي على 50 microliters من مزيج الإيقاف (Stop Mix) بتركيز 20x والمبرد مسبقاً.

قم بالرج الدوامي (Vortex) ووضع الخلايا المجمعة على الثلج. ولمنع ترسب خلايا الخميرة، قم برج معلقات الخلايا في الأنابيب المخروطية سعة 15 milliliter دوامياً كل خمس دقائق تقريباً طوال فترة المطاردة (chase). وعند الانتهاء من جمع كافة العينات، قم بترسيب الخلايا المجمعة عن طريق الطرد المركزي عند 6, 500 ×g وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية.

قم بإزالة السائل الطافي عن طريق السحب بالماصة أو الشفط. أصبحت الخلايا الآن جاهزة للتحلل القلوي. قم بتحضير الخلايا للتحلل القلوي بإضافة 100 µL من الماء المقطر إلى كل كتلة خلوية، ثم أعد تعليقها عن طريق السحب والضخ بالماصة.

أضف 100 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.2 molar إلى كل عينة. اخلط العينات باستخدام جهاز الـ vortex. حضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.

في هذه المرحلة، لم يتم تحلل خلايا الخميرة، ولم يتم تحرير البروتينات. بعد ذلك، يتم تجميع الخلايا في شكل كرة (pellet) عن طريق الطرد المركزي بسرعة 18,000 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية. ثم يُزال الطافي عن طريق السحب بالماصة أو الشفط.

لتحليل الخلايا، أضف 100 µL من Laemmli Sample Buffer إلى كل راسب خلوي. أعد تعليق العينة عن طريق السحب والدفع بالماصة. حضن العينات عند 95 °C لمدة خمس دقائق لتمسخ البروتينات بالكامل.

قم بطرد المحاليل المستخلصة مركزياً عند 18,000 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة لترسيب المواد غير القابلة للذوبان. يكون السائل الطافي، وهو البروتين المستخلص المذاب، جاهزاً للفصل بواسطة SDS PAGE وتحليل Western blot اللاحق. بدلاً من ذلك، يمكن تخزين المحاليل المستخلصة عند درجة حرارة -20 °C.

تم تحليل استقرار Deg1-Sec62، وهو ركيزة نموذجية للتحلل المرتبط بالشبكة الإندوبلازمية في الخميرة، باستخدام منهجية مطاردة السيكلوهيكسيميد. تهاجر بروتينات Deg1-Sec62 في تقنية SDS PAGE كأنواع متعددة وتتحلل بسهولة في الخلايا من النوع البري. ويُعد Pgk1 ضابط تحميل لا تتغير وفرته في الظروف التي تم اختبارها.

أدى فقدان أي من إنزيم يوبيكويتين ليغاز hrd1 المقيم في الشبكة الإندوبلازمية أو الإنزيم المرافق لليوبيكويتين ubc7 إلى استقرار بروتين Deg1-Sec62 بشكل كبير، مما يؤكد الدور الملاحظ مسبقاً لهذه البروتينات في تحلل Deg1-Sec62. يُعد Cue1 بروتيناً عبر غشائي يقوم بتثبيت ubc7 في غشاء الشبكة الإندوبلازمية وتنشيط الإنزيم، ولكن لم يتم استقصاء مدى الحاجة إلى cue1 في تحلل Deg1-Sec62 بشكل مباشر. إن الملاحظة المستخلصة من هذه الدراسة بأن Deg1-Sec62 قد استقر في غياب cue1، أكدت وجود دور لـ cue1 في عملية التحلل المرتبط بالشبكة الإندوبلازمية لبروتين Deg1-Sec62.

تم قياس نتيجة لطخة ويسترن كمياً باستخدام برنامج تصوير. ولمقارنة وفرة بروتين Deg1-Sec62 بين العينات، تم تحديد نسبة شدة الإشارات المعدلة لبروتين Deg1-Sec62 إلى بروتين Pgk1 لكل عينة. ومن المهم تذكر أن هذا الإجراء يقدم تقريراً مباشراً عن حركية تحلل مجموعة مستقرة من البروتين المستهدف.

لتصوير تحلل المجموعة الناشئة من بروتين معين، يمكن استخدام تقنيات أخرى، مثل تجارب النبض والمطاردة (pulse-chase experiments). ولا تنسَ أن السيكلوهكسيميد وأزيد الصوديوم مادتان شديدتا السمية، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب التلامس المباشر مع هذه المواد الكيميائية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.