التطبيق التتابعي من coverslips الزجاج لتقييم الضاغطة تصلب العدسة الفأر: الانفعال والمظهرية تحليلات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الصلابة الانضغاطية وهندسة عدسات الماوس باستخدام نهج بسيط وغير مكلف. يمكن أن تجيب هذه الطريقة على الأسئلة الرئيسية في حقل العدسة. مثل كيفية تأثير الاضطرابات الجينية والتجريبية المختلفة على الخصائص الميكانيكية الحيوية للعدسة.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها دقيقة وقابلة للتكرار ولا تتطلب معدات باهظة الثمن أو متخصصة. توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على خصائص عدسات الفأر ، مع إمكانية التطبيق على الكائنات الحية النموذجية الأكبر مثل الفئران والأرانب. يعد تصور الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات تشريح العدسة وتطبيق الغطاء يصعب تعلمها بدون عرض توضيحي.

ستظهر الإجراء كاثرين تشنغ ، باحثة ما بعد الدكتوراه من مختبري. ابدأ التشريح باستخدام ملقط منحني لضغط الأنسجة المحيطة بعين الفأر القتل الرحيم لإخراج العين من التجويف. ثم قم بإزالة العين وضعها في طبق تشريح يحتوي على PBS طازج تحت مجهر تشريح.

قطع العصب البصري بالقرب من مقلة العين قدر الإمكان. وأدخل ملاقط دقيقة ومستقيمة برفق وبعناية في مقلة العين من خلال الفتحة التي يخرج فيها العصب البصري من الجزء الخلفي من العضو. قم بعمل شق بعناية بالمقص من الجزء الخلفي إلى حافة القرنية ، مع الحرص على عدم إتلاف العدسة.

استمر في الشق على طول التقاطع بين القرنية والصلبة، على الأقل في منتصف المسافة حول مقلة العين. وادفع القرنية برفق لإزالة العدسة من العين من خلال الفتحة. بعد ذلك ، استخدم ملقطا مستقيما ذو رؤوس دقيقة لإزالة أي حطام كبير لا يزال متصلا بالعدسة بعناية.

وتأكد بصريا من أن العدسة خالية من التلف. قبل ساعتين على الأقل من بدء قياسات الصلابة، استخدم ميزان تحليلي لوزن ما لا يقل عن 10 زلات غطاء من نفس الصندوق. حدد متوسط وزن زلات الغطاء.

بعد ذلك ، قم بترطيب زلات الغطاء مسبقا ومرآة الزاوية اليمنى في درجة حرارة الغرفة PBS. أثناء ترطيب المواد ، املأ غرفة القياس ب 65 إلى 75 مل من PBS. وضع الغرفة تحت مجهر تشريح مضبوطة على تكبير 30 X ، مع إضاءة من الأسفل ومصدر ضوء الألياف الضوئية على الجانبين الأيسر والأيمن.

عندما يكون الغطاء جاهزا ، ضع مرآة الزاوية اليمنى في الغرفة على مسافة ثابتة من الفتحة التي سيتم استخدامها لتثبيت العدسة. بعد ذلك ، باستخدام ملقط منحني ، انقل العدسات المقطوعة بعناية إلى غرفة القياس. اضبط مصدر الطاقة البصرية على 80٪ من الحد الأقصى لشدة الضوء ، واضبط خرج مصدر الطاقة بناء على الإضاءة المحيطة وتفضيلات المستخدم وجودة الصورة حسب الحاجة.

احصل على صور العرض العلوي للعدسات غير المحملة من أعلى الغرفة مباشرة. بعد ذلك ، التقط صورة لحافة المرآة في التركيز ، متبوعة بصورة عرض جانبية للعدسة غير المحملة من خلال المرآة خارج الفتحة. بعد ذلك ، ضع العدسة في فتحة الحفر ، وتأكد من أن العدسة مثبتة بشكل آمن ومستقيم داخل الفتحة الموجودة على قطبها الأمامي أو الخلفي.

التقط صورة للعدسة في المرآة. ثم ضع غطاء برفق على العدسة. بعد دقيقتين، التقط صورة عرض جانبية أخرى للعدسة المحملة.

استمر في إضافة زلات الغطاء، والحصول على صور الرؤية الجانبية بعد دقيقتين من إضافة كل زلة غطاء، حتى يتم تطبيق إجمالي 10 زلات غطاء. بعد ذلك ، قم بإزالة جميع زلات الغطاء ، وانتظر دقيقتين أخريتين ، واحصل على صور منظر جانبي للعدسة داخل وخارج المقاطعة. وصورة عرض علوي للعدسة خارج الفتحة.

لتحديد حجم نواة العدسة ، ضع العدسة في طبق بتري نظيف مليء ب PBS واستخدم ملقطا ناعما ومستقيما لفك رأس العدسة برفق. لإزالة خلايا الألياف القشرية ، قم بلف العدسة بين أصابع القفازات. بعد ذلك ، اشطف نواة العدسة برفق في PBS وضع النواة مرة أخرى في غرفة القياس.

احصل على صورة لنواة العدسة من خلال مرآة الزاوية اليمنى. أخيرا ، لتحليل الصور ، استخدم برنامج تحليل الصور المناسب لقياس الأقطار الاستوائية والمحورية للعدسات قبل وبعد كل خطوة تحميل. قم بقياس قطر كل نواة عدسة أيضا.

في هذه التجربة التمثيلية ، تم قياس صلابة وأبعاد عدسات الفئران التي يبلغ عمرها شهرين وأربعة وثمانية أشهر وتم حساب السلالات المحورية والاستوائية. الإجهاد المحوري هو دالة لوغاريتمية للحمل المطبق مع انخفاض ذو دلالة إحصائية يعتمد على العمر في السلالات المحورية والاستوائية تحت الحد الأقصى للحمل المطبق ، مما يشير إلى أن عدسة الماوس تتصلب مع تقدم العمر. تم استخدام بيانات الصورة التي تم جمعها خلال هذه التجربة أيضا لتحديد العديد من الخصائص المورفولوجية الأخرى للعدسة.

كما هو متوقع ، زادت الأقطار المحورية والاستوائية وحجم العدسة مع تقدم العمر. تشير نسبة العرض إلى الارتفاع إلى أن العدسة لها قطر استوائي أكبر قليلا من القطر المحوري. وهذه المعلمة لم تتغير مع تقدم العمر.

يزداد قطر نواة العدسة وحجمها وجزء منها مع تقدم العمر ، مما يشير إلى أن نواة العدسة تعيد تشكيلها لزيادة الحجم النسبي مع تقدم العدسة في العمر. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في 30 إلى 45 دقيقة لكل عدسة ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم وضع العدسة بالتساوي داخل فتحة الفتحة، والسماح للعدسة بالضغط على الاسترخاء لمدة دقيقتين بين كل زلة غطاء إضافية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم الصلابة الانضغاطية وقياس الأشعة لعدسات الماوس باستخدام التطبيق المتسلسل لزلات الغطاء. تمهد هذه التقنية الدقيقة والبسيطة وغير المكلفة الطريق لباحثي العدسات لاستكشاف التأثيرات الميكانيكية الحيوية للطفرات الجينية في الفئران.