عالية تحليل فحص المحتوى لتقييم الآثار السمية للمكونات الضارة والمؤذية يحتمل (HPHC)

العام لهذا النهج ، الذي يجمع بين محلل الخلايا في الوقت الفعلي القائم على المعاوقة ، والنظام الأساسي القائم على الفحص عالي المحتوى ، هو توفير معلومات حول الجرعات الفعالة والسمية والتأثيرات البيولوجية ، للحصول على ملف تعريف السموم للمركبات المختبرة. يمكن أن يساعد هذا النهج في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال علم السموم. معالجة ، على سبيل المثال ، السموم الخلوية والسمية الجينية واستجابات الإجهاد الخلوي.

علاوة على ذلك ، لا يقتصر الأمر على توفير معلومات حول العديد من المعلمات البيوكيميائية والمورفولوجية في وقت واحد فحسب ، بل يمكن أيضا تطبيقها على مجموعة مختلفة من أنواع الخلايا ونماذج زراعة الخلايا. نظرا للاختصاص القضائي والقيود ، سيتم تنفيذ النهج بأكمله أثناء تقييم قطعة قصيرة فقط من المركب. للسبب نفسه ، سيتم عرض بروتوكول واحد فقط لإظهار تقييم فحص المحتوى العالي.

سيعرض الإجراء ستيفانو أكالي وألكسندر لوران ، فنيان من مختبري. لرؤية الخلايا الظهارية القصبية البشرية الطبيعية ، أو خلايا NHBE ، قم ببرمجة الأداة لتحديد عدد ومدة قياسات المعاوقة. في هذه الدراسة ، يتم تسجيل البيانات كل 15 دقيقة لمدة 48 ساعة.

قم بقياس خلفية اللوحة عن طريق سحب 50 ميكرولترا من الوسط الدافئ مسبقا في كل بئر من لوحة RTCA سعة 96 بئرا. تمثل هذه الخطوة مطلبا تقنيا للأداة لحساب المقاومة الكهربائية المتوسطة لاستخدامها كمرجع أساسي للحسابات القائمة على الخلية. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية بتركيز 144،000 خلية لكل مليلتر إلى الوسط الموجود بالفعل في كل بئر من لوحة RTCA.

بمجرد تسخين الخلية ، من المهم جدا ترك الصفيحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة للسماح للخلايا بالالتصاق والحصول على توزيع متجانس للخلايا. احتضان لوحات RTCA في المهد في الحاضنة ، وابدأ في تسجيل البيانات لمدة 24 ساعة القادمة ، زائد أو ناقص ساعتين ، قبل الجرعات. للتحكم الإيجابي ، قم بتخفيف محلول مخزون الستاروسبورين 10 مللي مولار ، من واحد إلى 10 ، في DMSO.

أضف خمسة ميكرولترات من التخفيف إلى 195 ميكرولتر من الوسط للحصول على محلول عمل 5x. بالنسبة للمكونات الضارة والتي يحتمل أن تكون ضارة ، قم بإذابة كل منها في السيارة لتوليد محلول مخزون مولي واحد. بعد ذلك ، قم بتخفيف كل محلول مخزون من مادة الاختبار ، من واحد إلى 10 ، في وسط لتوليد محلول 100 ملليمول.

قم بإنشاء اللوحة الرئيسية المركبة عن طريق إضافة المتوسط أولا بالإضافة إلى 10٪ مركبة في الآبار من B إلى F ، ومحلول 100 مللي مولار في البئر A. قم بإجراء خمس خطوات ، من واحد إلى 10 ، تخفيف تسلسلي للحصول على حلول العمل 5x. للجرعات ، أوقف أداة RTCA مؤقتا ، وافتح المهد لإزالة لوحة التعريض ، وضع اللوحة في أداة درجة حرارة RTCA لتجنب تبريد الخلايا ، مما قد يؤثر على قياس المقاومة. أضف 25 ميكرولترا من محلول 5x من اللوحة الرئيسية المركبة إلى الخلايا في ثلاث نسخ ، مع الحفاظ على نفس ترتيب الجرعات كما هو الحال في اللوحة الرئيسية المركبة.

لا تقم بإزالة وسط زراعة الخلايا الموجود. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من محلول التحكم الإيجابي 5x إلى الخلايا الموجودة في النصف الأيمن من الصف السفلي ، دون إزالة وسط الثقافة الموجود. وبالمثل ، أضف 25 ميكرولترا من الوسط إلى الخلايا الموجودة في النصف الأيسر من الصف السفلي.

بعد إغلاق اللوحة باستخدام مانع التسرب ، ضع اللوحة مرة أخرى في مهد RTCA ، وأغلقها. أعد تشغيل تسجيل البيانات لوقت التعرض المطلوب. بعد تسجيل البيانات ، قم بتحليل بيانات صلاحية خلية RTCA لتحديد مادة الاختبار التي يجب استخدامها في تحليل HCS.

في هذه التجربة ، يتم اختيار 1-أمينونافتالين والزرنيخ والكروم وكروتونالديهايد لتحليل HCS. لرؤية خلايا NHBE ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية عند 120،000 خلية لكل مليلتر إلى كل بئر من صفيحة سوداء مكونة من 96 بئرا. بعد ترك لوحة HCS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، للسماح للخلايا بالالتصاق بالآبار ، احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 24 ، زائد أو ناقص ساعتين ، قبل الجرعات.

للتحكم الإيجابي ، قم بتوزيع 40 ميكرولترا من محلول المخزون لكل عنصر تحكم إيجابي في العمود الثاني. ثم قم بتوزيع 20 ميكرولترا من السيارة في العمودين الثالث والخامس. و 40 ميكرولتر من السيارة في العمود الرابع.

اسحب 12 ميكرولترا من الآبار في العمود الثاني ، وقم بتوزيعها على الآبار في العمود الثالث ، واخلطها. استمر حتى يتم الحصول على التخفيف التسلسلي النهائي بثلاث جرعات ومركبة لكل مركب تحكم إيجابي. لتوليد لوحة التحكم الإيجابية ، قم بإعداد تخفيف من واحد إلى 40 في وسائط الجرعات الثلاث والمركبة.

لصنع اللوحة الرئيسية المركبة ، أعد تعليق وتخفيف كل محلول مخزون من مواد الاختبار ، من واحد إلى 10 في الوسط بتركيز 100 ملليمول. قم بإجراء عمليات التخفيف باستخدام وسيط مع 10٪ مركبة للحصول على جرعات 5x المحددة لكل مادة اختبار. كل من عناصر التحكم الإيجابية واللوحة المركبة جاهزة الآن لجرعات فوق لوحة التعرض.

بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من محاليل 5x من اللوحة الرئيسية المركبة إلى الخلايا في ثلاث نسخ ، مع الحفاظ على نفس ترتيب الجرعات كما هو الحال في اللوحة الرئيسية المركبة. لا تقم بإزالة وسط زراعة الخلايا الموجود. بعد ذلك ، أضف 25 ميكرولترا من محلول 5x من لوحة التحكم الإيجابية إلى الخلايا الموجودة في الصف السفلي ، مع الحفاظ على نفس ترتيب الجرعات كما في لوحة التحكم الإيجابية.

قم بإعداد حجم كاف من محلول تلطيخ الخلايا الحية كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بتخفيف كل من صبغة الميتوكوندريا وصبغة نفاذية الغشاء في محلول تلطيخ الخلايا الحية ، وفقا لتعليمات البائع. أضف 50 ميكرولترا من محلول تلطيخ الخلايا الحية إلى كل بئر من اللوحة المعينة مقايسة السمية الخلوية.

لا تقم بإزالة وسط زراعة الخلايا ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2. قم بشفط محلول الوسط والتلوين برفق وأضف 100 ميكرولتر من محلول التثبيت لكل بئر. ثم احتضن الطبق لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام.

بعد الحضانة ، قم بشفط محلول التثبيت برفق واغسله مرة واحدة باستخدام 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الغسيل. قم بإزالة مخزن الغسيل ، وأضف 100 ميكرولتر لكل بئر من 1x مخزن مؤقت للنفاذية إلى كل بئر ، قبل الحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. قم بشفط المخزن المؤقت للنفاذية ، واغسل اللوحة مرتين باستخدام 100 ميكرولتر ، لكل بئر ، من عازلة الغسيل.

بعد ذلك ، قم بشفط مخزن الغسيل وأضف 100 ميكرولتر من 1x Blocking buffer لكل بئر. ثم احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. قم بتخفيف الجسم المضاد للسيتوكروم سي ، من واحد إلى 250 ، في محلول الأجسام المضادة الأولي.

بعد ذلك ، قم بشفط المخزن المؤقت للحجب وأضف 50 ميكرولترا ، لكل بئر ، من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى كل بئر ، قبل احتضانه لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام. تمييع الجسم المضاد للفأر ، واحد إلى 500 ، في الجسم المضاد الثانوي والمحلول النووي. أيضا ، قم بتخفيف الصبغة النووية ، من واحد إلى 1 ، 000 ، في الجسم المضاد الثانوي والمحلول النووي.

بعد شفط محلول الأجسام المضادة الأولي ، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر ، لكل بئر ، من عازلة الغسيل ، باستخدام غسالة اللوحة. قم بشفط مخزن الغسيل ، وأضف 50 ميكرولترا ، لكل بئر ، من الجسم المضاد الثانوي والمحلول النووي إلى كل بئر من اللوحة. الآن ، احتضن الطبق لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام.

بعد شفط الجسم المضاد الثانوي والمحلول النووي ، اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من كل بئر من المخزن المؤقت للغسيل باستخدام غسالة اللوحة. ثم أضف 100 ميكرولتر ، لكل بئر ، من محلول الغسيل. اللوحة جاهزة الآن للتقييم على أداة HCS وبدأ الاستحواذ.

يتم عرض نتائج جدوى خلايا RTCA التمثيلية لعلاج مادة الاختبار. يتم الحصول على تأثير سام يعتمد على الجرعة على مدار 24 ساعة من التعرض فقط مع 1-أمينونافتالين ، والزرنيخ ، والكروم ، وكروتونالديهايد ، حيث عرضوا جميعا LD50 محسوبا أقل من 20 ملليمول. لم يتم الحصول على أي تأثير سام مع المركبات الأخرى.

تظهر هنا ، نتائج HCS التمثيلية فقط لعلاج 1-أمينونافتالين. يؤدي التأثير السام ل 1-aminonaphtalene إلى إحداث ضرر شديد لغشاء الخلية ، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية غشاء الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة ، بعد أربع ساعات من التعرض. يؤثر المركب أيضا على الميتوكوندريا ، مما يؤدي إلى زيادة الكتلة بعد أربع ساعات من التعرض ، إلى جانب إطلاق السيتوكروم C ، والذي يمكن اكتشافه بعد ذلك في النوى بعد أربع و 24 ساعة من التعرض.

بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون يومين إلى ثلاثة أيام ، حيث يتطلب معظمها حوالي ساعة يوميا من الوقت العملي للإعداد والجرعات. اعتمادا على البروتوكول المحدد ، يتطلب فحص المحتوى العالي ثلاث ساعات ونصف كحد أقصى لتنفيذ إجراء التلوين بأكمله. أثناء محاولة هذا الإجراء، ضع في اعتبارك أنه على الرغم من أن تحديد نطاق أوسع من نقاط النهاية يضيف تعقيدا إلى سير العمل، إلا أنه لن يزيد من الوقت بشكل كبير.

مع سير العمل الأمثل ، في الواقع ، يمكن تقييم العديد من اللوحات بالتوازي. سيؤدي التطوير المستمر لمنصة فحص المحتوى العالي ، بما في ذلك إعداد الخلايا المؤتمتة بالكامل ، والتخفيف المركب ، والجرعات والتلوين ، وإضافة نقطة نهاية جديدة ، إلى زيادة قدرة منصة فحص المحتوى العالي كأداة قوية للتنميط السموي. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين نقاط نهاية السمية المتعددة والمفردة في مثل هذه الإنتاجية العالية سيجعلنا خطوة أخرى إلى الأمام في جهودنا للحد من الاختبارات الكيميائية في.