من خلال المرآة: المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية من الخلايا واحدة لدراسة العلاج المضادة للسرطان

الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة الاستجابة العلاجية المضادة للسرطان في الخلايا المفردة المستنبتة. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث السرطان، بما في ذلك الاستجابة العلاجية غير المتجانسة ومصير الخلايا. للبدء، قم بتحضير خلايا HT1080 في أطباق معتمدة للاستنبات، وذلك تحت غطاء تدفق صفائحي معقم ومعتمد، وفقاً للبروتوكول المكتوب، ثم قم بتحضين الخلايا في حاضنة استنبات خلايا مرطبة.

قبل يومين من التصوير، يتم توزيع 50,000 خلية من نوع HT1080 FuGENE في كل بئر من العدد المطلوب من آبار طبق زجاجي ذو قاع رقم 1.5 ومكون من 12 بئراً. يتم ضبط عدد الخلايا الموزعة بناءً على معدل نموها والطبق المستخدم لتحقيق درجة تلاقي تبلغ 60% تقريباً عند بدء التجربة.

قم بضبط الغرفة البيئية لتصل الرطوبة إلى 80% تقريباً، مع ضبط درجة الحرارة عند موضع العينة على 37 درجة مئوية. تأكد من ملء خزان المياه بالماء المقطر المعقم وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة. بعد ذلك، قم بتشغيل الغرفة البيئية على إعداد درجة الحرارة المطلوب، ووضعها في منصة المجهر وقم بتثبيتها.

إذا كانت هناك أي مساحة فارغة بين الغرفة العلوية للمنصة والقطعة الملحقة بالمنصة، فقم بوضع قطع من فيلم البارافين فوق حواف فتحة القطعة الملحقة بالمنصة، قبل إدخال الغرفة فيها، لربط الغرفة بالمنصة. تأكد من عدم وجود أي توصيلات تشد الغرفة، حيث يمكن لكليهما أن يتسبب في حدوث تداخلات حركية (motion artifacts). أدخل طبقاً وهمياً يحتوي على الماء في الغرفة، واترك الغرفة لتصل إلى حالة التوازن عند 37 °C ثم حافظ على درجة حرارة مستقرة.

لإعداد عملية التصوير، قم بتشغيل المجهر والحاسوب وأي ملحقات مطلوبة. وبناءً على نوع مصدر الضوء، انتظر حتى تبرز الحاجة لتشغيله. ومع وضع turret العدسات الشيئية في وضعية منخفضة، اختر العدسة الشيئية 20x بفتحة عددية 0.7.

بعد ذلك، ضع العينة فوق العدسة الشيئية، مما سيسهل العثور على الخلايا عندما تكون العينة داخل الغرفة. وبعد نقل الخلايا المراد تصويرها إلى الغرفة البيئية، وفقاً للبروتوكول المكتوب، أغلق الغرفة بإحكام للحفاظ على استقرار البيئة وقم بتشغيل الغاز الجوي. بعد ذلك، اختر ظروف التصوير التي من شأنها منع التسمم الضوئي عن طريق تقليل أوقات التعرض واستخدام إضاءة ذات شدة منخفضة.

لتحديد المستويات X وY وZ والأطوال الموجية المطلوبة لكل موضع سيتم تصويره. وبالنسبة للتصوير الزمني طويل المدى لمعظم العمليات الخلوية، يتم التقاط صورة واحدة كل عشر إلى عشرين دقيقة. يوفر التحليل الزمني الأعلى نقاط بيانات أكثر وتتبعاً أكثر دقة للخلايا، ولكنه يؤدي إلى زيادة التعرض للضوء المتكامل ومجموعات بيانات أكبر.

بما أن خلايا HT1080 FuGENE تحتوي على بروتينات فلورية خضراء وحمراء ديناميكية، استخدم أوقات التعرض التالية واستخدم تجميع بكسلات (bin) بمقدار اثنين في اثنين. من الإعدادات المتقدمة، قم بتفعيل التركيز التلقائي المتحكم به برمجياً باستخدام الإعدادات الافتراضية. حدد نطاق تركيز تلقائي بمقدار 10 micrometers مع حجم الخطوة الموصى به.

في طبق التجربة، وللحد من الانزياح الحراري، استبدل نصف الوسط بوسط يحتوي على العقار المطلوب الذي تم تدفئته إلى 37 درجة Celsius. وأخيراً، ابدأ التصوير الزمني (time lapse) والتقط الصور وفقاً للبروتوكول المكتوب. تعرض هذه المقاطع أمثلة لزوج متطابق من خطوط خلايا MCF7 المشتقة من سرطان الثدي، والتي تختلف فقط في حالة p53، حيث عولجت بعقار مضاد للسرطان يثبط kinesin-5، مما أدى إلى توقف الانقسام الميتوزي.

كما يظهر في هذا الشكل، عند إزالة p53 عن طريق التثبيط المستقر لـ p53، وبدلاً من التوقف بعد الخروج من الانقسام المتساوي، تمر الخلايا بدورات متكررة حيث تدخل جولة ثانية من الانقسام المتساوي بدلاً من التوقف، وتخرج من الانقسام المتساوي دون انقسام. تظهر هنا خلايا Hela المشتقة من سرطان عنق الرحم والتي تعبر بشكل مستقر عن علامة الكروماتين Histone 2b مدمجة مع mCherry وbeta tubulin مدمجة مع EGFP. عند معالجتها بعقار paclitaxol المثبت للأنابيب الدقيقة، يختل اصطفاف الكروموسومات وفصلها أثناء الانقسام المتساوي، مما يؤدي إلى تكوين نتوءات نووية ونويات صغيرة تكون عرضة لتلف DNA.

يعبر هذا الخط الخلوي بشكل مستقر عن مؤشرين فلوريين لدورة الخلية لبروتين ubiquitin، وهما CDT1 باللون البرتقالي، وgeminin باللون الأخضر، ويتقدم عبر دورة الخلية بشكل طبيعي. وعندما تُعالج الخلايا نفسها بمثبط CDK46، تتقدم الخلايا عبر طور G2 وتنقسم بشكل طبيعي، ثم تتوقف بقوة في طور G1، مما يشير إلى إمكانية حدوث تأثيرات مثبطة للخلايا فعالة في الأورام المتنامية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تتبع استجابة خلية واحدة بشكل مباشر وفي الوقت الفعلي على مدار عدة أيام، بدلاً من استنتاج تلك الاستجابات.