نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز الهجرة في الخلايا غير المهاجرة عادة ، لتحديد مركبات معينة تنشط أو تمنع الهجرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هجرة الخلايا وغزوها ، وقد تكون ذات أهمية خاصة للعلماء الذين يعملون مع الخلايا الجذعية العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تحليل الخلايا غير المهاجرة وغير الغازية أثناء عملية أن تصبح مهاجرة وغازية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تحديد المركبات الجديدة التي تمنع الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة ، أو EMT ، والذي يحدث في الأورام الدبقية البشرية عالية الدرجة التي يعتقد أنها مشتقة من الخلايا الجذعية العصبية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على EMT والخلايا الجذعية العصبية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة السرطانات الظهارية الأخرى ، مثل سرطان الثدي أو الرئة أو القولون. في اليوم الجنيني 14.5 ، تأكد من العمر الصحيح لأجنة الفئران من خلال وجود تكوين الأرقام الأولية في الطرف الأمامي للفئران.

بعد ذلك ، انقل الأجنة إلى أطباق بتري فردية غير مغلفة مليئة ب PBS المثلج ، والتي توضع تحت مجهر استريو. استخدم زوجا من الملقط ذو الرؤوس الدقيقة لإزالة الهياكل الجنينية. احتفظ بالأجنة في وسط التمدد على الجليد.

باستخدام ملقطين دقيقين معقمين بالأوتوكلاف ، وبدءا من تقاطع telencephalon النامية والدماغ ، اسحب في وقت واحد للأمام والخلف ، لإزالة جلد الرأس والجمجمة. بعد ذلك ، حدد حدود الدماغ المتوسط والدماغ الخلفي التي تفصل الدماغ المتوسط عن الدماغ المعيني ، وقم بقطع الدماغ المعيني عند أو أسفل حدود الدماغ الأوسط والخلفي. أمسك كتلة الدماغ المتوسط بزوج من الملقط ، وقطع الاتصال بين telencephalon و diencephalon في قاعدة الجمجمة مع الهيكل العظمي للوجه ، واغمر كتلة telencephalon ، diencephalon ، mesencephalon في طبق بتري غير مغلف من وسط التمدد على الجليد.

عندما يتم حصاد جميع الكتل العصبية بنفس الطريقة ، قم بنقل كتلة telencephalon ، diencephalon ، mesencephalon إلى PBS طازج بارد تحت المجهر. لفصل الدماغ المتوسط عن الدماغ ، قم أولا بقطع الأنسجة بين الدماغ والدماغ الدماغي. بعد ذلك ، قم بتقسيم نصفي الكرة الأرضية ، وتحديد البروز العقدي الإنسي والجانبي ، والتي يمكن رؤيتها من خلال الثقبة المستقبلية المتداخلة.

تشريح على طول خط مستقيم عند التقاطع بين البروز العقدي الإنسي وجانبي والقشرة الأمامية ، متبوعا بخط مستقيم عبر القشرة والحصين والضفيرة المشيمية. اقطع خطا مستقيما ثانيا عبر القشرة والحصين والضفيرة المشيمية عند تقاطع البروز العقدي الذيلي والقشرة الخلفية. بعد ذلك ، قم بتسطيح الدماغ ، وحدد الحافة القشرية التي تحتوي على الحصين والضفيرة المشيمية.

افصل الحافة القشرية عن القشرة ، واترك حجم القشرة مطابقا لحجم البروز العقدي. اقلب كتلة بروز القشرة والعقدة بحيث يلامس الجانب البطيني سطح الطبق ، وتكون السحايا متجهة لأعلى. قم بتثبيت البروز العقدي على سطح الطبق بيد واحدة ، واستخدم الملقط في اليد الأخرى لتقشير السحايا.

بعد ذلك ، قم بقطع كل قشرة على طول السماوة العقدية الجانبية ، حوالي نصف مسافة قطر البروز العقدي الجانبي. لتحضير مزارع الزرع ، قم بتقطيع القشرة إلى نباتات قطرها أقل من 400 ميكرون ، باستخدام شبكة 400 ميكرون أسفل طبق التشريح كمرجع إذا لزم الأمر. بعد ذلك ، انقل جميع النباتات إلى طبق بتري طازج مع وسط تمدد مثلج.

بعد ذلك ، قم بإزالة الفيبرونيكتين الزائد من طبق زراعة الأنسجة 35 ملم المطلي مسبقا واترك الطبق يجف. بعد ذلك ، ضع الطبق المغطى بالفيبرونكتين على شبكة 10 × 10 ملم وأضف ملليلترا واحدا من وسط التمدد البارد إلى وسط الطبق ، مما يسمح للوسط بتكوين قطرة كروية. ضع ما يصل إلى ثمانية نباتات في وسط القطرة مع مسافة لا تقل عن ثلاثة ملليمترات بين كل قطعة من الأنسجة.

بعد ذلك ، ضع الطبق بحذر في حاضنة زراعة الخلايا دون اهتزاز للسماح للنباتات بالالتصاق بالسطح المطلي بالفبرونكتين. بعد ساعة واحدة ، املأ الطبق بحجم نهائي يبلغ ملليلترين من وسط التمدد بالإضافة إلى عوامل النمو أو مواد الاختبار ذات الأهمية ، وأعد الطبق إلى الحاضنة. في هذه التجربة ، تم زرع النباتات المستخرجة في وسط 500 طبق استزراع شبكي ميكرون واستزراعها في عوامل نمو مختلفة.

في الكنترول و TGF Beta 1 وحده المعالجة ، لوحظ انتشار قوي ، إلى جانب عدم وجود هجرة تقريبا. ومع ذلك ، تسبب BMP4 في هجرة الخلايا الوسيطة واستجابة الانتشار. مع الجمع بين BMP4 و TGF Beta 1 مما أدى إلى أقوى هجرة وانتشار لجميع المجموعات.

بمجرد إتقانها ، يمكن عزل الخلية الجذعية العصبية من 10 إلى 15 جنينا في ساعتين تقريبا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم الحفاظ على جميع الأجنة والخلايا في وسط مثلج. يوفر هذا النظام الفعال من حيث التكلفة والقابل للتكرار بدرجة كبيرة المرونة في استخدام الخلايا المفردة أو مزارع الزرع لدراسة هجرة الخلايا وغزوها في المختبر.

زراعة الخلايا في صفائح كبيرة متعددة الآبار بتحليل تأثيرات مجموعة متنوعة من المركبات على الهجرة والغزو بالتوازي. علاوة على ذلك ، يمكن تكييف النظام بسهولة لفحص الإنتاجية العالية للمركبات الجديدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الجذعية العصبية مع إمكانية الخضوع ل EMT من المنطقة المناسبة من القشرة النامية.