تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي تصوير في الوقت الحقيقي متعددة الخلايا حيوية في المكروية ورم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الأحداث الديناميكية داخل البيئة المجهرية للورم عن طريق المجهر متعدد الفوتونات عالي الدقة والتصوير الحي داخل الجسم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية حول البيئة المجهرية للورم، مثل الأحداث الديناميكية المشاركة في النفاذية الوعائية والتفاعلات متعددة الخلايا. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية رصد وقياس حركية الأحداث في البيئة المجهرية للورم.

قبل البدء في الإجراء، قم بتشغيل جميع مكونات المجهر والليزر، بما في ذلك ليزرات الفوتونين والكواشف. واضبط صندوق التسخين على 30 °C لتسخين المنصة مسبقاً. امسح منصة المجهر وقطعة إدخال المنصة باستخدام 70% ethanol.

عندما تكون المنصة جافة، ضع قطرة كبيرة من الماء على عدسة المجهر الشيئية ذات الفتحة العددية 25 x 1.05 NA للحفاظ على التلامس البصري مع غطاء الشريحة، ثم ضع غطاء شريحة بسمك 1.5 فوق منفذ التصوير المدرج. بعد ذلك، قص قطعة بطول 30 سنتيمتر من أنبوب البولي إيثيلين. ضع الوسادة المطاطية فوق غطاء الشريحة.

باستخدام الملاقط، قم بكسر إبرة مقاس 31 من وصلتها البلاستيكية، ثم أدخل الطرف الثلم لمحور الإبرة في الأنبوب. أدخل إبرة مقاس 31 وثبتها في الطرف الآخر من أنبوب PE. بعد ذلك، املأ حقنة سعة 1 cc بمحلول PBS معقم وقم بتوصيل الحقنة بالإبرة مقاس 31.

استخدم محلول PBS لطرد كل الهواء من الأنبوب والإبرة. بعد ذلك، املأ سرنجة سعة 1 cc بـ 200 µL من الواسم الوعائي المناسب وسرنجة أخرى بالبروتين القابل للحقن المناسب. قبل البدء في الجراحة، تأكد من التخدير السليم من خلال التحقق من عدم وجود استجابة عند قرص إصبع القدم، ثم ضع مراهم العين للفأر المخدر.

بعد ذلك، ضع الحيوان على منصة جراحية تحت مصباح حراري لزيادة الدورة الدموية في الذيل. وبعد مرور دقيقتين، قم بتعقيم الذيل باستخدام 70% ethanol وأدخل طرف القسطرة ذات القياس 31 gauge لمسافة تتراوح بين مليومترين إلى ثلاثة مليمترات في الوريد الجانبي للذيل. ثم ضع قطعة من الشريط اللاصق المخبري بطول واحد سنتيمتر على القسطرة لتثبيت الإبرة بشكل موازٍ للوريد على طول الذيل.

بعد تثبيت القسطرة، امسح السطوح البطنية وسطح الورم باستخدام 70% ethanol. ثم ارفع الجلد فوق البطن واستخدم مقصاً معقماً لإجراء شق تحت جلدي بطول سنتيمتر واحد تقريباً على طول الخط الناصف البطني، مع الحرص على تجنب ثقب الصفاق. قم بقطع النسيج الضام الذي يربط الغدة الثديية والورم بالصفاق برفق لتعريض الورم.

بعد ذلك، وباستخدام المقص والملاقط، قم بإزالة اللفافة والدهون برفق من السطح المكشوف للورم. وعندما يصبح الورم مكشوفاً، انقل الفأر إلى منصة التصوير المسخنة مسبقاً. استخدم أشرطة لاصقة مخبرية لتثبيت الغطاء الزجاجي، ثم ضع الورم في الفتحة الموجودة في وسادة مطاطية تغطي الشريحة الزجاجية فوق عدسة المجهر الشيئية.

عندما يكون الحيوان في الوضعية الصحيحة، املأ حجرة الوسادة المطاطية بمحلول PBS للحفاظ على ترطيب الأنسجة وضمان الاتصال البصري مع غطاء الشريحة. ضع مستشعر طوق مسبار مقياس التأكسج النبضي حول الرقبة لمراقبة العلامات الحيوية للحيوان، وضع صندوق التسخين فوق الحيوان. بعد ذلك، استخدم المجهر IPs للتركيز على الخلايا الورمية الفلورية الموجودة على سطح الورم والمنطقة التي تقع فيها الأوعية الدموية المتدفقة.

بمجرد اختيار المنطقة ذات الاهتمام، حوّل المجهر إلى وضع التصوير متعدد الفوتونات واستخدم منظم التركيز لتحريك الشيئية إلى موقع البداية المطلوب. بعد ذلك، انقر فوق زر الموضع Z العلوي لتعيين الحد الأعلى لسلسلة z ومعاينة شبكة ألياف الكولاجين على سطح الورم في قناة توليد التوافقي الثاني. ثم حرك الشيئية إلى عمق التصوير المطلوب وانقر فوق زر الموضع z السفلي لتعيين الحد الأدنى لسلسلة z.

بعد ذلك، أدخل القيمة المطلوبة في حقول حجم الخطوة. ثم، انتقل إلى لوحة التصوير الزمني (Time Lapse Panel) وأدخل وقت الفاصل الزمني المناسب. وبمجرد تحديد معلمات التصوير، استبدل المحقنة المتصلة بالقسطرة بمحقنة تحتوي على صبغة وسم الأوعية الدموية، ثم احقن ببطء مقداراً أقصاه 200 µL من محلول الصبغة، مع التأكد من دخول المحلول إلى الوريد.

بعد الحقن، أعد محقنة PBS إلى القسطرة وابدأ التصوير بالفاصل الزمني لخطوة z. وعندما يتم الحصول على جميع الصور، استبدل محقنة PBS بالمحقنة التي تحتوي على البروتين القابل للحقن، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في الأنبوب. ثم احقن معلق البروتين ببطء في الفأر واستبدل المحقنة بمحقنة تحتوي على PBS.

يمكن تتبع البلاعم باستخدام الديكستران الموسوم فلوريسنتياً بوزن 70 kilodalton، والذي يتراكم في البلاعم البلعمية. ويسمح الوسم المزدوج للخلايا الورمية والبلاعم بتصور التفاعل المباشر بين هذين النوعين من الخلايا في الوقت الفعلي. ولتصور التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية للورم، يمكن أيضاً استخدام النقاط الكمومية لوسم الحيز الوعائي.

نظرًا لأن حجمها كبير بما يكفي بحيث لا تنتشر بسهولة عبر الفراغات بين الشرايين. يسهل التصوير المستمر عالي الدقة رصد أحداث النفاذية الوعائية وتقدير حركية تسرب الدكستران وتطهيره. في هذا الحقل الرؤيوي كمثال، لوحظت ذروة التسرب الوعائي بين 29 و 34 دقيقة، كما يتضح من إشارة TMR خارج الأوعية.

يمكن أن يوفر حقن صبغات وعائية أو بروتينات إضافية لتحفيز النفاذية الوعائية رؤية أعمق للأحداث الإشارية التي تنظم هذه النفاذية. وبالفعل، في غضون الثواني القليلة الأولى من الحقن، يمكن ملاحظة خروج 10 kilodaltons من dextran FITC من الأوعية الدموية، بينما يظل 155 kilodalton من dextran TMR محصوراً داخل الحيز الوعائي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ساعة واحدة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر إزالة النسيج الضام بلطف دون إتلاف سطح الورم، مع الحفاظ على ترطيب سطح الورم. وباتباع هذا الإجراء الخاص بالديناميكيات الخلوية، يمكن تصور هجرة الخلايا الورمية هذه للإجابة على أسئلة إضافية حول اتجاه هجرة الخلايا الورمية والاجتياح الوعائي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور الأحداث الخلوية الديناميكية في البيئة المجهرية للورم باستخدام المجهر متعدد الفوتونات الحي.