تمديد الوقت الفاصل بين حيوي داخلي تصوير في الوقت الحقيقي متعددة الخلايا حيوية في المكروية ورم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور الأحداث الديناميكية داخل البيئة المكروية للورم عبر ميركروسبي متعدد الفوتون عالي الدقة داخل الحيوية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول البيئة الدقيقة للورم مثل الأحداث الديناميكية التي تشارك في نفاذية الأوعية الدموية والتفاعلات متعددة الخلايا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن ملاحظة حركية الأحداث في البيئة المكروية للورم وقياسها.

قبل البدء في الإجراء، قم بتشغيل جميع مكونات المجهر والليزر، بما في ذلك ليزر الفوتون وأجهزة الكشف. واضبط صندوق التسخين على 30 درجة مئوية لتدفئة المسرح. امسح مرحلة المجهر وإدراج المرحلة بنسبة 70٪ من الإيثانول.

عندما تجف المرحلة ، ضع قطرة كبيرة من الماء على هدف مجهر NA 25 × 1.05 للحفاظ على التلامس البصري مع زجاج الغطاء ووضع زجاج غطاء بسمك 1.5 فوق منفذ التصوير الإدخال. ثم قم بقطع قطعة 30 سم من أنابيب البولي إيثيلين. ضع الوسادة المطاطية أعلى زجاج الغطاء.

باستخدام الملقط ، قم بكسر إبرة قياس 31 من تركيبها البلاستيكي وأدخل الطرف الضعيف لمحور الإبرة في الأنبوب. أدخل وقم بتوصيل إبرة قياس 31 في الطرف الآخر من أنبوب PE. بعد ذلك ، املأ حقنة واحدة سم مكعب ب PBS معقم وقم بتوصيل المحقنة بإبرة قياس 31.

استخدم PBS لطرد كل الهواء من الأنبوب والإبرة. ثم ، واحدة حقنة سم مكعب مع 200 ميكرولتر من ملصق الأوعية الدموية المناسب وأخرى مع البروتين المناسب عن طريق الحقن. قبل البدء في الجراحة ، تأكد من التخدير المناسب مع عدم الاستجابة لقرص إصبع القدم ووضع مراهم العين على الفأر المخدر.

بعد ذلك ، ضع على منصة جراحية تحت مصباح حراري لزيادة دوران الذيل. بعد دقيقتين ، قم بتعقيم الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول وأدخل طرف القسطرة قياس 31 ، من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات في وريد الذيل الجانبي. بعد ذلك ، ضع شريط المختبر بطول سنتيمتر واحد على القسطرة لتثبيت الإبرة موازية للوريد على طول الذيل.

عندما يتم تأمين القسطرة ، قم بمسح الأسطح البطنية والورم بنسبة 70٪ من الإيثانول. ال, رفع الجلد فوق البطن واستخدام مقص معقم لعمل شق تحت الجلد حوالي سنتيمتر واحد على طول خط الوسط البطني للبطن, مع الحرص على تجنب ثقب الصفاق. قم بقطع النسيج الضام الذي يربط الغدة الثديية والورم برفق بعيدا عن الصفاق لكشف الورم.

ثم ، باستخدام المقص والملقط ، قم بإزالة اللفافة والدهون برفق من السطح المكشوف للورم. عندما يتعرض الورم ، انقل الفأر إلى مرحلة التصوير الدافئ مسبقا. استخدم أشرطة المختبر لتأمين زجاج الغطاء، ثم ضع الورم في فتحة وسادة مطاطية تغطي زلة الغطاء فوق هدف المجهر.

عندما يكون في موضعه ، املأ حجرة الوسادة المطاطية ب PBS للحفاظ على رطوبة الأنسجة والحفاظ على الاتصال البصري مع زلة الغطاء. ضع مستشعر طوق مسبار مقياس التأكسج النبضي حول الرقبة لمراقبة العلامات الحيوية للحيوان ووضع صندوق التسخين فوق. بعد ذلك ، استخدم عناوين IP المجهرية للتركيز على الخلايا السرطانية الفلورية على سطح الورم والمنطقة الواقعة مع الأوعية الدموية المتدفقة.

بمجرد تحديد منطقة الاهتمام ، قم بتبديل المجهر إلى وضع التصوير متعدد الفوتون واستخدم أداة ضبط التركيز لنقل الهدف إلى موقع البدء المطلوب. ثم انقر فوق الزر العلوي للموضع Z لتعيين الحد الأعلى لسلسلة z وتصور شبكة ألياف الكولاجين على سطح الورم في قناة التوليد التوافقي الثانية. ثم حرك الهدف إلى عمق التصوير المطلوب وانقر فوق الزر السفلي للموضع z لتعيين الحد الأدنى للسلسلة z.

بعد ذلك ، أدخل القيمة المطلوبة في حقول حجم الخطوة. ثم قم بالتبديل إلى لوحة اللقطات المتتابعة وأدخل وقت الفاصل الزمني المناسب. بمجرد تحديد معلمات التصوير ، استبدل المحقنة المرفقة بالقسطرة بحقنة من صبغة وضع العلامات الوعائية وقم بإدارة 200 ميكرولتر كحد أقصى من محلول الصبغة ببطء ، مع الحرص على دخول المحلول إلى الوريد.

بعد الحقن ، أعد حقنة PBS إلى القسطرة وابدأ تصوير الفاصل الزمني للخطوة z. عندما يتم الحصول على جميع الصور ، استبدل حقنة PBS بالمحقنة التي تحتوي على البروتين القابل للحقن ، مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات في الخط. ثم قم بحقن معلق البروتين ببطء في الماوس واستبدل المحقنة بحقنة تحتوي على PBS.

يمكن تتبع البلاعم باستخدام 70 كيلودالتون وديكستران المسمى بالفلورسنت والتي تتراكم في ميكروفاج البلعمة. يسمح وضع العلامات المزدوجة للخلايا السرطانية والميكروفاج على التفاعل المباشر مع هذين النوعين من الخلايا ليتم تصورها في الوقت الفعلي. لتصور التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية للورم ، يمكن أيضا استخدام النقاط الكمومية لتسمية مساحة الأوعية الدموية.

لأنها كبيرة بما يكفي بحيث لا تنتشر بسهولة عبر الفراغات بين الشرايين. يسهل التصوير المستمر عالي الدقة التقاط أحداث نفاذية الأوعية الدموية والقياس الكمي لحركية تسرب ديكستران وإزالته. في مجال الرؤية هذا المثال ، لوحظت ذروة التسرب الفراغي بين 29 و 34 دقيقة كما يتضح من إشارة TMR الوعائية الإضافية.

يمكن أن يوفر حقن أصباغ أو بروتينات وعائية إضافية للحث على نفاذية الأوعية الدموية نظرة ثاقبة لأحداث الإشارات التي تنظم نفاذية الأوعية الدموية. في الواقع ، خلال الثواني القليلة الأولى من الحقن ، يمكن ملاحظة 10 كيلودلتون من ديكستران FITC تتخارج من الأوعية الدموية ، بينما يظل 155 كيلودالتون في ديكستران TMR محصورا في مساحة الأوعية الدموية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر إزالة النسيج الضام برفق دون الإضرار بسطح الورم والحفاظ على رطوبة سطح الورم. باتباع هذا الإجراء من الديناميكيات الخلوية ، يمكن تصور هجرة الخلايا السرطانية للإجابة على أسئلة إضافية حول اتجاه هجرة الخلايا السرطانية والتدحير. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصور الأحداث السلية الديناميكية في بيئة مكروية للورم عن طريق الفحص المجهري متعدد الفوتون بين الأفعال.