دراسة منظمة Supramolecular من الضوئى الأغشية داخل الأنسجة ورقة بكسر تجميد من قبل كرو مسح الميكروسكوب الالكتروني

الهدف العام لهذه التقنية هو دراسة التنظيم فوق الجزيئي لأغشية التمثيل الضوئي باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني للمسح بالتبريد لعينات أنسجة الأوراق المكسورة بالتجميد. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الخلية ، مثل التوصيف المورفولوجي للخلايا والعضيات ، وتوزيع مجمعات البروتين المتكاملة للغشاء ، وتوطين المعادن الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن كسر التجميد يتم إجراؤه على أنسجة الأوراق ، وبالتالي يتم التحقيق في التنظيم فوق الجزيئي لغشاء الثايلاكويد داخل العضية الأصلية والسياق الخلوي.

بينما يتم توضيح هذه الطريقة هنا لعينة بيولوجية ، يمكن أيضا تطبيقها على المواد الهلامية والبوليمرات وأنظمة توصيل الأدوية. بشكل عام ، يجب أن يدرك الأفراد الجدد في هذه الإجراءات أنه لن يتم تجميد جميع العينات جيدا أو مكسورة بشكل صحيح. لإجراء التثبيت بالتبريد لأنسجة الأوراق عن طريق التجميد بالضغط العالي ، ابدأ باستخدام زاوية شفرة الحلاقة لخدش الجزء السفلي من التجويف 0.1 ملم من صفائح الألومنيوم من 0.1 إلى 0.2 ملم.

قم بإعداد ما لا يقل عن اثنتي عشرة من الصفائح الدموية لست عينات. ثم استخدم الإيثانول المطلق لغسل الصفائح الدموية واحتفظ بها في طبق نظيف. بعد تحضير آلة التجميد ذات الضغط العالي ، املأ صندوق العينات بالنيتروجين السائل.

باستخدام شفرة حلاقة ، قم بقطع قطعة صغيرة من الأوراق من النبات واستخدم الملقط لوضع الأنسجة داخل أنبوب طرد مركزي دقيق نصف مملوء بسداسي ديكان واحد. للتسلل إلى الفراغات بين الخلايا لأنسجة الأوراق ، أدخل طرف جهاز التسلل ، المعد كما هو موضح في بروتوكول النص في الفتحة الموجودة في غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، واسحب المكبس لإنشاء فراغ. بعد حوالي 30 ثانية ، حرر المكبس.

بعد ذلك ، باستخدام الملقط ، قم بإزالة قطعة الورقة من الأنبوب. استخدم شفرة الحلاقة لقطع قطعة صغيرة بما يكفي لتناسب الصفائح الدموية. وإذا لزم الأمر ، قم بقص الورقة بسمك أقل من 0.2 ملم.

لمنع انهيار الأنسجة ، يتم ترشيح الأوراق بالسائل قبل التجميد بالضغط العالي. يتم الاحتفاظ بسماكة العينة أقل من 200 ميكرون من أجل زيادة فرصة الحصول على عينة مزججة. ضع صفيحة نظيفة مع جانب الخدش لأعلى في حامل آلة التجميد.

ثم ضع قطعة الورقة المقطوعة في الصفائح الدموية. استخدم سداسي ديكان لملء المساحة المتبقية من الصفائح الدموية قبل استخدام صفيحة أخرى مع مواجهة الخدوش للورقة لإغلاق الشطيرة. أغلق الحامل وشده.

قم بتجميد العينة بالضغط على زر النفاثة. ثم انقل الحامل بسرعة إلى النيتروجين السائل. استخدم ملاقط مسبقة التبريد لإزالة الساندويتش من الحامل ، مع الحرص على عدم كسرها.

هناك خطوتان حاسمتان في الإجراء: كسر التجميد ، وهي عملية عشوائية ولا يمكن تقييم نجاحها إلا في طلاء CRYO-SEM والطبقة المزدوجة ، وهو أمر مطلوب للحصول على صور عالية التكبير مع الحد الأدنى من تلف الحزمة. أثناء تحضير وبرمجة آلة كسر التجميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، ضع الكربون البلاتيني ، أو مسدس Pt / C ، عند 45 درجة ، ومسدس الكربون عند 90 درجة. قم بتبريد مرحلة نظام التجميد والكسر إلى 140 درجة تحت الصفر أو 160 درجة مئوية تحت الصفر.

ثم قم بتوصيل مكوك نقل الفراغ بالتبريد بالماكينة واستخدم النيتروجين السائل لملء غرفة المكوك. أدخل حامل عينة التكسير بالتجميد في محطة التحميل ، ومع إغراق النيتروجين السائل غرفة محطة التحميل. بعد ذلك ، باستخدام ملاقط عالية الدقة ، قم بتحميل شطيرة مجمدة على الحامل وشدها في مكانها.

ثم اقلب الحامل للتحقق من تثبيت الساندويتش في مكانه ، وكرر ذلك لشطيرة ثانية. افصل المكوك المبرد عن آلة كسر التجميد وقم بتوصيله بمحطة التحميل. ثم افتح صمام المكوك ، وأدخل الذراع المتراجع في الحامل ، وأغلقه في مكانه ، وأعد إدخال الذراع مع الحامل في المكوك.

بعد إعادة توصيل المكوك بآلة كسر التجميد ، أدخل الحامل في الغرفة ، باستخدام ذراع التراجع. الآن قم بمحاذاة السكين الصغير لكسر التجميد مع الارتفاع بحيث يقضي على الصفائح الدموية العلوية للسندويشات. باستخدام سكين ميكروتوم ، كسر السندويشات بسرعة.

ثم ارفع السكين على الفور لمنع تلوث العينات بالحطام الذي يتشبث بالسكين. ضع الغالق المبرد فوق المستوى المكشوف حديثا لحماية العينات من التلوث المحتمل بجزيئات الماء في الغرفة. بعد ذلك ، لطلاء العينات بالبلاتين ، اضغط على إعداد لإظهار الطبقة 1 على الشاشة.

ثم قم بتشغيل مسدس Pt / C بالضغط على زر GUN 1 متبوعا بزر التشغيل. افحص معدل التبخر ، وبمجرد أن يصل إلى 0.02 إلى 0.04 نانومتر في الثانية ، اضغط على زر القياس لمراقبة سمك الطبقة المترسبة مع تعريض العينات في نفس الوقت. للطلاء بالكربون ، حدد GUN 2 متبوعا بزر التشغيل.

بمجرد أن يصل معدل التبخر إلى حوالي 0.1 نانومتر في الثانية ، اضغط على زر القياس وفي نفس الوقت حرك الغالق لكشف العينات. عند اكتمال الطلاء ، قم بتسخين المرحلة إلى 120 درجة مئوية تحت الصفر. لإعداد المجهر الإلكتروني الماسح للعمل بالتبريد ، من القائمة الرئيسية حدد المرحلة وتهيئة المرحلة والتأكيد.

ضمن علامة التبويب Vacuum ، انقر فوق الزر Vent لتنفيس غرفة المجهر. ثم حدد Tools، وGoto Panel وافتح لوحة Stage Points List. حدد موضع CRYO EXCHANGE لنقل المرحلة إلى الإحداثيات المناسبة لقبول حامل العينة.

أثناء ارتداء زوج نظيف من القفازات ، افتح غرفة العينة وأدخل مرحلة التبريد على المسرح الرئيسي للمجهر. أغلق الغرفة ، وتحت علامة التبويب تفريغ ، انقر فوق الزر Pump. بعد ذلك ، قم بتبريد المجهر عن طريق ملء المجهر بالنيتروجين السائل.

بمجرد أن تنخفض درجة حرارة المرحلة إلى أقل من 120 درجة مئوية تحت الصفر ، قم بتنشيط وظيفة الحرارة في وحدة نقل التبريد لتسخين المرحلة إلى 120 درجة مئوية تحت الصفر. الآن قم بتوصيل مكوك النقل بالتبريد بالمجهر ونقل حامل العينة باستخدام ذراع التراجع إلى مرحلة التبريد المجهرية. باستخدام عصا التحكم ، حرك حامل العينة بعناية بالقرب من العدسة الموضوعية.

في علامة التبويب فتحات العدسة ، حدد فتحة العدسة 10 ميكرون. ثم ، في علامة التبويب Gun ، انقر نقرا مزدوجا فوق حقل EHT Target ، وأدخل 10 كيلو فولت لهدف EHT ، وانقر فوق موافق. بعد ذلك ، لتشغيل الجهد المتسارع ، انقر فوق علامة التبويب EHT السفلية وحدد EHT On.In علامة التبويب Detectors ، حدد InLens من القائمة المنسدلة. ثم انقر فوق علامة التبويب المسح واختر سرعة مسح تساوي واحدة ، وهي مسح سريع لتقليل تلف الشعاع ، ودقة تخزين تبلغ 1024 × 768 بكسل.

في القائمة المنسدلة تقليل التشويش، حدد متوسط الأسطر، واضبط قيمة n إلى 20 إلى 30 سطرا للبحث. بعد ذلك، بالنقر فوق مفتاحي التحكم وعلامة التبويب على لوحة المفاتيح، استخدم وظيفة النقطة المركزية لنقل العينة إلى مناطق الاهتمام مع التكبير في نفس الوقت لتحديد المناطق ذات الخلايا المكسورة. بعد تحديد المناطق ذات الخلايا المكسورة ، امسح العينة أثناء التكبير للعثور على البلاستيدات الخضراء المكسورة.

ثم قم بتغيير متوسط قيمة الخط n إلى أكبر من 100 ، لتقليل الضوضاء. في علامة التبويب مسح ضوئي، اضغط على تجميد لإيقاف الفحص. بالضغط على Control Shift Tab على لوحة المفاتيح ، يتم استخدام وظيفة الميزة المركزية لتكبير وجوه كسر البلاستيدات الخضراء المثيرة للاهتمام. ويتم الحصول على صور عالية التكبير باستخدام نفس المعلمات كما كان من قبل.

أخيرا ، اضغط على حفظ TIFF زر لحفظ الصورة. قم بإجراء تحليل الصور وفقا لبروتوكول النص. يوضح هذا الشكل صورة بالتبريد SEM لصفيحات تحتوي على قطعة أوراق Craterostigma Pumilum مجمدة عالية الضغط مع منطقة كبيرة من الخلايا المكسورة.

في هذا المثال ، قطعة الورقة مفقودة. لكن بقيت بعض أنسجة الأوراق ، متصلة بأخاديد السكين على الصفائح الدموية. بعد العثور على كسر ناجح ، يتم الحصول على صور منخفضة التكبير للخلايا لتحديد المناطق ذات الأهمية ، مثل البلاستيدات الخضراء المكسورة. يتم الحصول على صور للبلاستيدات الخضراء أحادية الكسر لتحديد وجوه كسر غشاء الثايلاكويد.

تظهر في هذا المثال صورة عالية التكبير لأغشية الثايلاكويد في أوراق C.Pumilum. يمكن تمييز وجوه الكسر الأربعة المختلفة. وجوه الكسر الخارجية للأغشية المكدسة وغير المكدسة ، EFs و EFu على التوالي ، والوجوه البروتوبلازمية للأغشية المكدسة وغير المكدسة ، PFs و PFu على التوالي.

النظام الضوئي II ، أو PS2 ، في كل من مناطق غشاء الجرانا المكدسة EFs ومناطق غشاء EFu stromalamellar. عند ترطيبها ، تكون كثافة PS2 أعلى بثلاث مرات تقريبا في EFs منها في EFu ، مما يميز الوجهين. أثناء جفاف C.Pumilum ، تنخفض كثافة PS2 في EFs تدريجيا ، لتصل إلى ما يقرب من نصف كثافته في الظروف الرطبة.

والجدير بالذكر أنه عند مزيد من الجفاف إلى خمسة إلى 10٪ من المحتوى المائي النسبي ، يتم تنظيم مجمعات PS2 في صفوف ومصفوفات. مهد تطوير تقنية النسخ المتماثلة للتجميد الطريق لدراسة حجم مجمعات البروتين الغشائي وترتيبها داخل الأغشية البيولوجية. يسمح الجمع بين الكسر بالتجميد والتجميد بالضغط العالي في التقلبات المجدية بفحص أنواع مختلفة من العينات بمقاييس متعددة الحجم ، من الأنسجة والمستويات الخلوية وصولا إلى المستوى الجزيئي في حالة شبه أصلية.

بالإضافة إلى التقنية الموضحة هنا ، يمكن أيضا تطبيق طرق مثل التحليل الطيفي للأشعة السينية المشتتة للطاقة ، EDS ، في التبريد. على سبيل المثال ، للقلوية للمعادن الحيوية.