إزالة المواد من مصادر خارجية من الجزء الخارجي من النوى المجمدة للتحقيق في المجتمعات القديمة البيولوجية آوى داخل

تتيح الغلاف الجليدي إمكانية الوصول إلى كائنات محفوظة استمرت في ظل ظروف بيئية سابقة. والهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن التنوع الخفي من خلال جمع المواد الخارجية وإزالتها بنجاح من العينات الجليدية الأسطوانية. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة تاريخية قيمة حول فترات زمنية محددة من خلال تحديد الكائنات التي تم استعادتها من الجليد الغلشي والتربة الصقيعية.

يُعد جمع عينة لبية معقمة في الميدان أمراً صعباً نظراً للاحتمالية العالية لإدخال ملوثات. لذا، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية تكمن في أن إزالة الملوثات تتم في بيئة مختبرية خاضعة للرقابة. ويُعد العرض المرئي لهذا البروتوكول أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الكشط وإزالة التلوث قد تكون صعبة التعلم إلى حد ما.

إن هذه العملية تتطلب فعلياً شخصين، لذا فهي تستلزم الكثير من الصبر والعمل الجماعي بشكل خاص. سيقوم بتقديم هذا الإجراء عالمان مساعدان من مختبري، وهما كارين فولي وروبرت جونز. يتطلب هذا البروتوكول نظافة دقيقة للغاية.

استخدم فرناً مضبوطاً على 450 درجة مئوية لخبز المواد التالية لمدة أربع ساعات: الرفوف المعدنية المعقمة والخالية من الأحماض النووية، والأدوات الزجاجية، والملاقط المعدنية، والصوف الزجاجي. استخدم غلافاً من رقائق الألومنيوم الثقيلة لمنع إعادة التلوث.

بعد ذلك، قم بتعقيم الإيثانول بنسبة 85% والماء فائق النقاء عن طريق الترشيح باستخدام مرشحات بحجم 0.22 ميكرون. يجب أن تبقى هذه السوائل عند درجة حرارة 4 درجة مئوية أو أقل، وإلا ستتسبب في تشقق العينة، مما يجعلها أكثر عرضة للتلوث. قم بتخزين الإيثانول عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.

تُحفظ المياه عند درجة حرارة 4°C. بعد ذلك، يتم تعقيم مسطرة بلاستيكية باستخدام ethanol بتركيز 70%، يليه محلول إزالة تلوث DNA ومحلول إزالة تلوث RNase. تُمسح كل مادة فور وضعها.

بعد ذلك، تُحفظ المسطرة في كيس Whirl-Pak معقم وخالٍ من الأحماض النووية. بعد ذلك، يتم تجهيز مساحة الغرفة الباردة عبر فرك الجدران والأرضيات وطاولة العمل المعدنية الموجودة فيها بمحلول مبيض بتركيز 1%. ثم تُضبط درجة حرارة الغرفة عند حوالي 11- درجة Celsius.

بمجرد التحضير، ارتدِ بدلات العمل الخفيفة وقفازات النيتريل والأقنعة عند التواجد في الغرفة الباردة للحد من أي فرصة لتلوث الغرفة أو العينات. يتطلب هذا الإجراء عمل شخصين معاً بالتزامن، وقد يكون ذلك تحدياً نظراً لكثرة فرص إعادة التلوث.

لضمان النجاح، نقوم بمراقبة بعضنا البعض، والتواصل، وتغيير القفازات بشكل متكرر. بعد تجهيز كل شيء، يتم إدخال المواد والعينات المعقمة إلى الغرفة الباردة، ووضعها على الطاولة التي تم تنظيفها بالمبيض. يتضمن ذلك المزارع المُحضرة من *S.marcescens*.

أولاً، يتم وضع لُب التربة الصقيعية على ورقة مجهزة من رقائق الألومنيوم. بعد ذلك، يتم تلقيح السطح الخارجي للُب بلطف بمزرعة مخففة من *S.marcescens* باستخدام سدادة رغوية معقمة. ثم، يُوضع اللُب على رف معدني معقم فوق صينية.

الآن، يتم مسح شفرة الميكروتوم الفولاذية تعقيمياً باستخدام 70%ethanol، ومحلول إزالة تلوث DNA، ومحلول إزالة تلوث RNase. بعد ذلك، يقوم الباحث A بتنظيف قفازات النيتريل الخاصة به بنفس الطريقة. ثم يمسك A باللب بزاوية 45 درجة فوق الصينية.

يقوم B بكشط حوالي خمسة مليمترات بلطف من السطح الخارجي لللب بالكامل، بما في ذلك النهايات، باستخدام النصل المعقم، بينما يقوم A بتدوير اللب بعد كل عملية كشط. وعند الحاجة، يجب إعادة تنظيف النصل باستخدام المحاليل الثلاثة. بعد ذلك، يقوم B بسكب إيثانول 95% المعقم بالترشيح بسرعة وبحذر فوق اللب بينما يقوم A بتدوير اللب.

بعد ذلك، يتم شطف اللب بسرعة بالماء. ثم يتم استبدال الرف المعدني الموجود فوق الصينية، ويوضع اللب على الرف الجديد. يقوم الباحث بتنظيف قفازاته المصنوعة من النيتريل ثم يضع اللب على رف نظيف فوق الصينية.

وفي هذه الأثناء، يقوم B برش اللب بالكامل بمحلول تطهير من DNA، يليه شطف بالماء المعقم بالترشيح. بعد ذلك، يقوم B برش اللب بالكامل بمحلول تطهير من RNase، يليه شطف آخر بالماء. وأخيراً، يتم وضع اللب في كيس Whirl-Pak معقم.

ابدأ بوضع رف معدني فوق طبق زجاجي داخل غطاء حيوي ذو تدفق رقائقي. ثم ضع اللب على الرف المعدني. اترك مسافة تتراوح من 2 إلى 5 ملليمتر من السطح الخارجي للب على أن تذوب على مدار 10 دقائق تقريبًا.

خلال هذه الفترة، قم بتدوير اللب بمقدار 90 درجة كل دقيقتين. بعد الإذابة، أمسك ببعض الصوف الزجاجي باستخدام الملقط وامسح سطح اللب بالكامل لجمع البكتيريا. بعد ذلك، قم بتلقيح الطبقين باستخدام الصوف الزجاجي.

بعد ذلك، قس الأبعاد الخارجية للنواة باستخدام المسطرة مع تجنب لمس النواة. كما يجب تلقيح طبقين إضافيين بالمزرعة الأصلية التي استُخدمت سابقاً لطلاء الجزء الخارجي من النواة للتأكد من حيوية اللقاحات. ثم انقل النواة إلى كيس معقم كبير واحفظها في درجة حرارة 80- درجة مئوية.

قم بتحضين الأطباق الملقحة عند 23 درجة Celsius لمدة أسبوع واحد، ثم افحصها بحثاً عن مستعمرات S.marcescens التي تتحول إلى اللون الأحمر عند درجة الحرارة هذه. ورغم أن هذا البروتوكول يتضمن سلسلة من الخطوات الحرجة، فإن إحدى أهم هذه الخطوات هي التحقق من نمو Serratia Marcescens. وفي حال عدم وجود مستعمرات مرئية لـ S.marcescens، انتقل إلى مرحلة الإذابة التالية.

إذا ظهرت مستعمرات من بكتيريا S.marcescens، فقم بكشط خمسة مليمترات أخرى من اللب وكرر الإجراء. تحقق مما إذا كانت بكتيريا S.marcescens قد نمت من المزرعة الأصلية التي تعرضت لدرجات الحرارة المنخفضة في الغرفة الباردة. جُمعت العينات من الجليد والتربة الصقيعية من نفق بطول 110 أمتار يقع في Fox، ألاسكا.

وفر النفق إمكانية الوصول إلى الغرين والرواسب الفيضية الغنية بالجليد. وقد جُمعت العينات في ثلاث مكررات. ونُفذت البروتوكولات المذكورة في المرافق الموجودة في نيوهامبشير.

تم تسلسل جين 16S rRNA من البكتيريا التي نمت من العينات اللبية. وقد سادت أنواع Pseudomonas، ولكن كانت هناك أيضًا أنواع مرتبطة بـ Planctomycetia. ومن المثير للاهتمام بشكل خاص غياب أنواع Serratia، مما يشير إلى أن بروتوكول التطهير قد أزال الحمض النووي الخارجي بشكل كافٍ.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطهير عينات الجليد والتربة الصقيعية (permafrost) بنجاح. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن إتمام خطوات المعالجة في الغرفة الباردة خلال 30 إلى 45 دقيقة إذا نُفذت بشكل صحيح. وعند تطبيق هذا الإجراء، من الضروري توخي الحذر الشديد بشأن كل ما تلمسه وفي جميع المواضع التي تتعامل معها.

عند الشك، قم ببساطة بتغيير القفازات وإعادة التعقيم. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تسلسل الأمبليكون (amplicon sequencing) والميتاجينوميات الشاملة (shotgun metagenomics) للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد تكوين الأنواع في تلك الفترة الزمنية، أو السمات الوظيفية التي سادت في ظل تلك الظروف البيئية.