الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

الهدف العام لطريقة الزخرفة الدقيقة القائمة على الاستنسل ، للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، هو توفير وسيلة بسيطة وقوية لتوليد تدرجات بيئية مكانية تتحكم في أنماط تمايز الخلايا الجذعية. يمكن أن تساعدك هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في زخرفة الأنسجة باستخدام نموذج الخلايا الجذعية البشرية ، مثل كيف يمكن أن تساعد التدرجات المكانية في قوى التصاق خلية الخلية ومصفوفة الخلية في تنظيم مصائر تمايز الخلايا الجذعية. تتمثل ميزة هذه الطريقة في أنها لا تتطلب تعديلا إضافيا للسطح لتوليد أنماط ECM لاصقة للخلايا لتلتصق بها.

هذا يعني أن الطريقة متوافقة مع العديد من تكوينات ECM والركيزة ، خاصة بكل خط خلية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، حيث يصعب تعلم خطوات النمط المجهري. لأنه يتطلب معالجة دقيقة ودقيقة للاستنسل والخلايا.

بالنسبة لهذا الإجراء ، يجب بالفعل تصميم وتصنيع استنسل PTMS. وبالمثل ، اجعل خلايا EFC البشرية تنمو على مصفوفة الغشاء القاعدي ، بحيث تكون المستعمرات جاهزة للبذر في وقت لاحق من الإجراء. للبدء ، قم بتحميل طبق يحتوي على 700 ميكرولتر من الإيثانول التحليلي بنسبة 70٪ ، في ماء فائق النقاء.

بعد ذلك ، ضع استنسل PDMS على المحلول ، واضع الطبق في خزانة السلامة الحيوية حتى يجف طوال الليل. في اليوم التالي ، تأكد من عدم تشكل فقاعات تحت الاستنسل. بعد ذلك ، قم بزرع الطبق حتى يمكن زرع الخلايا على الاستنسل.

قم بإعداد مجموعة من مصفوفة الغشاء القاعدي بجودة ESC البشرية عن طريق إضافة 16.7 مل من DMF12 ، لعمل محلول 1.5x والاحتفاظ به على الجليد. عالج الركيزة ب 100 واط من بلازما الأكسجين لمدة 90 ثانية. لا تفتح الطبق حتى يصبح داخل حجرة البلازما ، وقم بتغطيته بسرعة بعد العلاج.

سيمنع هذا العلاج الفقاعات من التكون عند غمر الركيزة في المحلول. الآن ، قم بتغطية الاستنسل ب 450 ميكرولتر من محلول مصفوفة الغشاء القاعدي المحضر 1.5x. ثم أغلق الطبق بالبارافيلم واحتضنه لمدة خمس ساعات.

قبل المتابعة ، تحقق من ألواح الآبار الستة لمستعمرات HESC المعدة. تحديد واستنشاق مستعمرات الخلايا المتمايزة التي فقدت مورفولوجيا HESC النموذجية. يجب أن تظهر جميعها مستديرة ، ولها مورفولوجيا ظهارية معبأة بإحكام ، ولها نسبة عالية من النواة إلى السيتوبلازم مع نوى بارزة.

ثم اغسل كل بئر من الخلايا المطلية بملليلترين من DMF12 مرتين. بعد الغسيل الثاني ، أضف ملليلترا واحدا من الإنزيمات الهاضمة إلى كل بئر ، مثل أكوتاز واحتضان الطبق لمدة ثماني دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، اضغط على اللوحة برفق لفصل جميع المستعمرات عن الركيزة.

بعد ذلك ، اشطف كل بئر بما لا يقل عن أربعة ملليلتر من الوسائط لكل مليلتر من الإنزيم الهضمي المطبق على البئر ، واجمع معلقات الخلية في أنبوب مخروطي واحد سعة 15 ملليلترا. الطرد المركزي للخلايا عند 200 غرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لتشكيل حبيبات الخلية. ثم استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من وسائط صيانة HESC ، مع استكمال 10 ميكرومولار من مثبط الصخور.

ثلاثي الخلايا برفق ثلاث مرات لتفتيت الكتل. بعد ذلك ، قم بتصحيح كثافة التعليق. امزجها جيدا ، واصنع 200 ميكرولتر 1:20 مخففا في الوسائط.

عد الخلايا في التخفيف باستخدام مقياس كثافة الدم. بعد ذلك ، قم بتخفيف التعليق الرئيسي حسب الحاجة ، باستخدام الوسائط المزودة بمثبط الصخور. للمتابعة ، أضف العدد المطلوب من الخلايا إلى كل استنسل معد.

يجب ترسيب طبقة أحادية فقط من الخلايا ، لذا انشرها بالتساوي. دع الاستنسل يجلس دون إزعاج لمدة خمس دقائق ، حتى تتمكن الخلايا من الاستقرار. بعد ذلك ، انقل الإستنسل المحمل بعناية إلى حاضنة ، مع الحفاظ على مستوى الأطباق طوال فترة النقل.

دع الخلايا تلتصق بالاستنسل على مدى فترة حضانة مدتها ساعة. بعد السماح للخلايا بالالتصاق ، افحصها تحت المجهر للتأكد من أنها فعلت ذلك بشكل صحيح. انقل الاستنسل مرة أخرى إلى الغطاء ، واستنشق الخلايا غير المتصلة من الاستنسل.

بعد ذلك ، أضف ملليلترين من خافض للتوتر السطحي غير الأيوني المتوافق مع 0.5٪ في DMF12 إلى المنطقة المحيطة بالاستنسل. قم بتدوير المحلول لتغطية الاستنسل. بعد ذلك ، استخدم زوجا من الملقط المعقم لتقشير الاستنسل برفق من الطبق.

بعد إزالة الاستنسل ، افحص الخلايا الدقيقة تحت المجهر. يمنع الفاعل بالسطح غير الأيوني هذه الخلايا من الجفاف. دع الخلايا الدقيقة تحتضن في محلول الوسائط المكمل بالتوتر السطحي لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.

بعد 10 دقائق ، استنشق المحلول بعيدا ، واغسل الطبق بملليلترين من وسط DMF12 العادي ، ثلاث مرات. بعد الغسيل ، أضف ملليلترين من وسط صيانة HESC مع مثبط الصخور. مرة أخرى ، افحص الخلايا للتحقق من أن الأنماط الدقيقة قد تشكلت بشكل صحيح.

ثم احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استنشق الوسط ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DMF12 ، ثم أضف ملليلترين من وسط التمايز المكمل ، لحث الخلايا على الخضوع لتمايز الأديم المتوسط. في وقت لاحق ، قم بتحليل النتائج.

تصنيع استنسل الخلية باستخدام قاطع الليزر ميزات 1000 ميكرون. يتكون الاستنسل من ورقة استنسل رقيقة ذات مزخرفة دقيقة من خلال الثقوب ، وحشية PDMS تستخدم لاحتواء الخلايا. باستخدام هذه الأداة ، تم فحص HESCs الدقيقة أثناء تمايز الأديم المتوسط.

أطراف مستعمرة H9-HESC على التصاقات إنتجرين أعلى من الخلايا الموجودة داخل المستعمرة. وبالتالي ، تتمايز الخلايا إلى خلايا الأديم المتوسط العضدية الموجبة على شكل حرف T ، عند تحفيزها باستخدام activan و BMP4 و FGF2. عندما تم تصميم هذه الخلايا في طبقات أحادية ذات أشكال هندسية مختلفة ، أدت الزوايا اليمنى الهندسية والمتناحيةة والانحناءات المحدبة إلى تركيز محلي لقوى الجر بوساطة الإنتجرين ، مما أدى إلى زيادة تمايز الأديم المتوسط.

أظهرت شدة التعبير على شكل حرف T في مواقع مختلفة داخل مستعمرة واحدة أن مدى تحريض الأديم الباطن الميزي كان أعلى بالفعل في الزوايا الحادة للمستعمرات المربعة والمستطيلة ، وفي الانحناءات المحدبة لقوس نصف دائري. يوضح هذا أنه يمكن تعديل القوى الميكانيكية بوساطة التصاق الخلية باستخدام الطريقة الموصوفة. قبل محاولة الإجراء ، من المهم تحسين وقت طلاء المصفوفة ، وهضم الخلية ووقت التعلق ، لخط الخلايا الجذعية البشري متعدد القدرات المحدد الذي تعمل به.