المظهرية والتحليل الوظيفي من المنشط خلايا تنظيم تي المعزولة من الفئران المصابة بفيروس المزمنة الليمفاوي المشيمي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقييم الوظيفة القمعية في المختبر للخلايا التائية التنظيمية ، المعزولة عن الفئران المصابة بالفيروسات المزمنة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة حول النمط الظاهري والوظيفة القمعية في المختبر للخلايا التائية التنظيمية المنشطة أثناء الإصابة الفيروسية المزمنة. يمكن لهذه التقنية تقييم التأثير المباشر للخلايا التائية التنظيمية على الفرد مع استجابة إيجابية للخلايا التائية في المختبر.

هذه ميزة كبيرة لهذه التقنية. ابدأ بنقل خمس مرات عشرة إلى خمس خلايا ليمفاوية طحالية إجمالية في 50 ميكرولترا من عازلة فاكس إلى كل بئر من صفيحة بئر 96 قاع U جديدة ، متبوعة ب 150 ميكرولتر من عازلة الفاكس. الطرد المركزي اللوحة والتخلص من المادة الطافية.

ثم قم بتحريك كريات الخلية وغسل الخلايا مرتين أخريين في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل بئر ، لمدة 20 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا مرتين في عازلة facs ، وصب المادة الطافية.

بعد ذلك ، قم بإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت ، متبوعا بغسلتين مع مخزن غسيل النفاذية. بعد الغسيل الثاني ، أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولترا من الجسم المضاد ل FOXP3. لتحضير الخرز المطلي ب CD3 CD28 ، انقل الحجم المناسب من الخرز المغناطيسي إلى أنبوب سعة 15 مليلتر ، وأضف حجما متساويا من PPS.

امزج المحلول برفق عن طريق سحب العينات ، وقم بالطرد المركزي للحبات المغناطيسية. في نهاية الغسيل ، تخلص من المادة الطافية ، وخفف الخرزات في 50 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل بئر. بعد ذلك ، قم ببذور 50 ميكرولترا من واحد في عشرة إلى الخلايا التائية التنظيمية الإيجابية CD4 الخامسة CD4 لكل بئر في صفيحة سفلية 96 بئر U ، متبوعة ب 50 ميكرولترا من واحد في عشرة إلى الخلايا التائية المستجيبة الإيجابية CD8 الخامسة لكل بئر.

عندما يتم طلاء جميع الخلايا ، أضف 50 ميكرولترا من الخرز المخفف المضاد ل CD3 CD28 إلى كل بئر ، وأضف ما يصل إلى 50 ميكرولترا من الوسط ليصل الحجم الإجمالي لكل بئر إلى 200 ميكرولتر. ثم غطي الطبق بورق الألمنيوم وضعيه على حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. لتحليل إنتاج السيتوكين للخلايا التائية الإيجابية CD8 ، بعد ثلاثة أيام من الثقافة ، قم بنقل المواد الطافية إلى صفيحة أخرى من 96 بئر وتحليل المواد الطافية بواسطة ELISA ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

لتحليل تكاثر الخلايا التائية الإيجابية CD8 ، اغسل صفيحة الخلايا باستخدام عازلة FAC ثلاث مرات. ثم أعد تعليق الكريات في 50 ميكرولترا من كوكتيل مناسب للأجسام المضادة ضد الخلايا التائية الإيجابية CD8 المتكاثرة لمدة 20 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين في عازلة facs وقم بإصلاحها لمدة 20 دقيقة في الظلام عند أربع درجات مئوية مع 100 ميكرولتر من مخزن التثبيت.

أخيرا ، اغسل الخلايا مرتين أخريين في مخزن مؤقت فاكس وأعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. ثم قم بقياس النسبة المئوية لتكاثر الخلايا التائية الإيجابية CD8 ثنائية التصنيف عن طريق قياس التدفق الخلوي. في الخلايا الليمفاوية الطحالية التي تم الحصول عليها من الفئران الساذجة والمصابة ، يتم تنظيم PD-1 على وجه التحديد في كل من الخلايا التقليدية FOXP3 السلبية CD4 الإيجابية و FOXP3 السلبية CD8 من استنساخ LCMV 13 الفئران المصابة.

تردد الخلايا التائية التنظيمية الإيجابية ل FOXP3 CD4 أعلى بمرتين في الفئران المصابة ب 13 استنساخ LCMV مقارنة بالفئران الساذجة ، حيث تعرض معظم الخلايا الإيجابية ل FOXP3 CD4 أيضا نمطا ظاهريا عاليا PD-1 المنشط. يمكن فصل الخلايا التائية المستجيبة الإيجابية CD8 بنجاح دون تلوث كبير بالخلايا المناعية الأخرى. بعد عزل الخلايا التائية التنظيمية ، يمكن الحصول على مجموعة مهيمنة من الخلايا التائية الإيجابية CD25 CD4 مع نقاء يزيد عن 80 بالمائة.

يؤدي تحفيز الخلايا التائية التنظيمية والمستجيبة المعزولة بواسطة الخرز المطلي ب CD3 CD28 إلى تثبيط الخلايا التائية المستجيبة الإيجابية CD8 بطريقة تعتمد على الجرعة. في الواقع ، عندما يتم زراعة الخلايا التائية المستجيبة الإيجابية CD8 بشكل مشترك مع الخلايا التائية التنظيمية المزمنة بنسبة واحد إلى واحد ، يتم تثبيط تكاثر الخلايا التائية المستجيب الإيجابي CD8 بشكل كبير. يتم أيضا تثبيط إنتاج إنترفيرون جاما بواسطة خلايا المستجيب الإيجابي CD8 بشكل كبير عندما يتم زراعة الخلايا التائية المستجيبة الإيجابية CD8 بشكل مشترك مع الخلايا التائية التنظيمية المنشطة من الفئران المصابة بشكل مزمن ، مقارنة بالزراعة المشتركة مع الخلايا التائية التنظيمية للراحة من الفئران الساذجة.

لقد وجدنا أنه يمكن إكمال هذه التقنية في غضون 80 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الخلايا التائية التنظيمية المعزولة حديثا مباشرة بعد عزلها. بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب لاستكشاف وظيفة الخلايا التائية التنظيمية في مرض التهابي مزمن.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد إجراء قمع الخلايا التائية التنظيمية في المختبر ، باستخدام نظام الزراعة المشتركة للخلايا التائية التنظيمية والمستجيبة.