تماما الجهاز الآلي الطرد المركزي ميكروفلويديك للكشف عن البروتين فائق الحساسية من الدم الكامل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحسين حساسية الكشف عن ELISA باستخدام ألياف نانوية طبيعية مغزول. يوضح هذا الفيديو كيفية تحقيق حساسية الكشف عن الفيمتومولار للبروتينات في 10 ميكرولتر من عينات الدم الكاملة في غضون 30 دقيقة. في منصة المختبر على القرص ، يتم استخدام قوة الطرد المركزي لنقل السائل عبر الغرف ، وتكون العملية الكلية مؤتمتة بالكامل.

يمكن تعزيز حساسية الكشف بشكل كبير من خلال دمج الألياف النانوية. ومع ذلك ، كانت المشكلة هي أن الألياف النانوية هشة للغاية ويصعب التعامل معها. في هذا الفيديو ، نقدم عملية بسيطة لربط حصائر ألياف ثاني أكسيد التيتانيوم الهشة على قرص بلاستيكي.

لتصنيع حصائر ألياف ثاني أكسيد التيتانيوم النانوية على ركيزة السيليكون عن طريق الغزل الكهربائي ، يتم أولا طلاء ركيزة السيليكون ، ومغلفة ب PDMS ، ويتم تجهيزها مسبقا. ثم يتم نقل حصيرة من الألياف النانوية إلى نظام PDMS المسبق ويتم تثقيب هذا المنتج لإنتاج قطعة دائرية للتركيب. قم بتغطية غرفة التفاعل بقطرة من PDMS كمادة لاصقة ، وقم بإرفاق القطعة الدائرية بقاع الغرفة.

ثم قم بمعالجة PDMS في الفرن. أخيرا ، قم بتجميع طبقات القرص في جهاز واحد كامل ل ELISA. تسمح لنا تقنية نقل الألياف النانوية هذه بالاستفادة من مساحة السطح العالية للألياف النانوية للتحليل الحيوي.

يوفر جهاز الطرد المركزي الدقيق التكامل الكامل والأتمتة لجميع العمليات المطلوبة في ELISA. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى الموجودة هي أنها يمكن أن تكتشف تركيزات الفيمتومولار للبروتينات من 10 ميكرولتر فقط من الدم الكامل. قم بإعداد محاليل السليفة كما هو موضح في بروتوكول الاختبار المصاحب.

ثم قم بتحميل المحلول في الدوار الكهربائي وقم بتصنيع الألياف النانوية عن طريق الغزل الكهربائي ، باستخدام الظروف المثلى. عندما يتم تحضير حصائر البوليمر النانوية ، قم بتكلسها في فرن تحت الفراغ. بعد التكليس ، يتم أخيرا تحضير حصائر الألياف النانوية المصنوعة من ثاني أكسيد التيتانيوم.

قم بإعداد التخطيط الدقيق باستخدام برنامج تصميم ثلاثي الأبعاد مثل SOLIDWORKS ، ونقل التصميم إلى آلة الطحن CNC. قم بتشغيل آلة الطحن CNC لتصنيع القرص بالقنوات والغرف. أصبح القرص وحصيرة الألياف النانوية جاهزا الآن للدمج.

تحضير غرفة فراغ ، ركيزة سيليكون وفلوروسيلان. قم بسيلان ركيزة السيليكون بالفلوروسيلان تحت الفراغ لمدة 30 دقيقة. قم بإعداد PDMS للضيف عن طريق تحضير البوليمر المسبق بعامل معالجة بنسبة 10 إلى واحد ، وقم بتدوير الطبقة على ركيزة السيليكون السيليكون السيلاني بسرعة 650 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية.

قم بمعالجة PDMS المطلي على الرقاقة السيلانية عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لجعلها لاصقة. الآن انقل حصائر الألياف النانوية هذه إلى السيليكون المطلي ب PDMS عن طريق تطبيق الضغط المناسب باستخدام جسم مسطح مثل شريحة زجاجية. اخبز العينة على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لمعالجة PDMS اللاصق تماما.

قم بتوزيع بضع قطرات من الإيثانول على حصائر الألياف النانوية المرفقة بطبقة PDMS ، وقم بعمل ثقب بقطر ستة ملليمترات باستخدام PunchIt. ثم قشر حصائر الألياف النانوية المثقوبة المرفقة على PDMS من ركيزة السيليكون. بعد ذلك ، قم بتغطية غرفة تفاعل الربط في القرص بحوالي 20 ميكرولترا من خليط PDMS ، وضع الألياف النانوية المرفقة على PDMS في الغرف.

بعد ذلك ، قم باحتضان القرص المدمج من الألياف النانوية عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. تحضير 1٪ حجم لكل حجم محلول GPDES في الإيثانول. ثم عالج الألياف النانوية في القرص ببلازما الأكسجين.

قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول GPDES على كل حصيرة من الألياف النانوية ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين في حاوية محكمة الغلق. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول GPDES عن طريق النقر على القرص الموجود على مساحة. يغسل بالإيثانول ويرفع ويخبز على حرارة 80 درجة مئوية لمدة ساعة.

بعد الخبز ، اغسليه بالإيثانول واضغط عليه لإزالته. كرر هذه العملية وجففها بتيار النيتروجين. لتثبيت الأجسام المضادة ، قم بتوزيع محلول الأجسام المضادة المخفف.

احتفظ بالأقراص في غرفة مرطبة ، واحتضانها عند 37 درجة لمدة أربع ساعات. اغسل المحلول المتبقي بمحلول الغسيل. الآن ، قم بتجميع القرص باستخدام شريط لاصق على الوجهين.

استخدم ضغطا معقولا لتجميع الطبقات في قرص كامل. املأ غرف تفاعل الربط بمخزن مؤقت مانع واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. يغسل مرتين باستخدام مخزن الغسيل ويخزن القرص على حرارة 40 درجة مئوية حتى الاستخدام.

قم بتحميل الكواشف ومخازن الغسيل و 10 ميكرولتر من الدم الكامل في غرف الكاشف والعينات. ضع القرص في آلة تصور مصممة خصيصا للمقايسة المناعية الآلية. يحتوي نظام التصور على دوار متصل بجهاز كمبيوتر لتشغيل القرص الآلي مع ضوء قوي وكاميرا CCD لالتقاط الصور.

قم بتدوير القرص بسرعة 3 ، 600 دورة في الدقيقة لمدة 60 ثانية لفصل خلايا الدم الحمراء. امزج البلازما مع الأجسام المضادة للكشف. انقل الخليط إلى غرفة التفاعل المدمجة مع حصيرة ثاني أكسيد التيتانيوم النانوية.

بعد التفاعل المناعي ، اغسل الألياف النانوية عن طريق نقل عازلة الغسيل إلى غرفة التفاعل. بعد ذلك ، انقل محلول الركيزة الكيميائي إلى غرفة تفاعل الربط ، واحتضانه في وضع الخلط لمدة دقيقة واحدة. أخيرا ، انقل محلول الركيزة المتفاعل إلى غرفة الكشف.

عند الانتهاء من كل التفاعل ، انقل القرص إلى نظام الكشف واقرأ إشارة الإضاءة الكيميائية باستخدام برنامج مصمم خصيصا. يمكن دمج تشغيل القرص ونظام الكشف في منصة واحدة. من خلال تحسين الجهد والفلورات ، تم الحصول على حصائر من الألياف النانوية الموحدة كما هو موضح في صورة SEM هذه.

من أجل تحسين وقت معالجة PDMS ، تم قياس قوة الالتصاق. إذا كانت قصيرة جدا ، فقد تم تضمين حصيرة الألياف النانوية في PDMS ، أو تقشيرها إذا كانت طويلة جدا. بعد التحسين ، تم بعد ذلك إرفاق حصيرة الألياف النانوية بثبات على PDMS.

النطاق الخطي للكشف عن البروتين التفاعلي C من نظامين أساسيين في هذا الرسم البياني. باستخدام مختبر سلامة الألياف النانوية على القرص ، تمكنا من تحقيق حساسية اكتشاف محسنة للغاية للبروتين التفاعلي C من 10 ميكرولتر فقط من المصل في غضون 30 دقيقة. تتطلب التقنيات المتاحة حاليا ، مثل ELISA المستندة إلى 96 بئرا ، حجم عينة أكبر ووقت اكتشاف أطول.

بشكل عام ، أظهرت ELISA المستندة إلى القرص المتكامل من الألياف النانوية نطاقا ديناميكيا واسعا من ستة أوامر من حيث الحجم مع حد اكتشاف يبلغ ستة فيمتومول من البروتين التفاعلي C. تجاوزت حساسية الكشف هذه بمساعدة مساحة السطح العالية التي توفرها الألياف النانوية المدمجة في القرص حساسية ELISA التقليدية ، والتي كانت محدودة عند 2,000 فيمتومول. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير جهاز الطرد المركزي الدقيق ، وكيفية دمج الألياف النانوية الطورية ، وكيفية الأداء على الكشف عن البروتين باستخدام ELISA.

يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة للكشف عن البروتينات منخفضة الارتباط في كمية صغيرة جدا من العينات البيولوجية.