التصنيف الفرعي لل العطيفة الصائمية SSP. doylei يعزل عن طريق PhyloProteomics أساس الطيف-قداس (MSPP)

الهدف العام من إجراء القياس الطيفي الكتلي هذا ، المسمى MSPP أو PhyloProteomics القائم على قياس الطيف الكتلي ، هو النوع الفرعي من البكتيريا على مستوى الإجهاد. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأحياء الدقيقة وعلم الأوبئة والنظافة. على سبيل المثال ، يمكن استخدامه لتحليل حالات تفشي المرض من خلال تصور ارتباط النشوء.

بالمقارنة مع طرق الكتابة الأخرى ، فإن MSPP رخيص لكل عينة وسريع جدا. تعد عدوى المستشفيات قضية ذات أهمية متزايدة ، ونأمل أن يتم توسيع مخطط MSPP الخاص بنا نحو التصنيف الوبائي للبكتيريا الأخرى ، أو حتى الفطريات. يوفر مخطط MSPP الخاص بنا نظرة ثاقبة على ارتباط السلالات ، لذلك من أجل التنبؤ بالأنماط الظاهرية ذات الصلة ، مثل مقاومة الأدوية ، أو حتى الفوعة ، فمن المنطقي تطبيقه حيث ترتبط هذه الأنماط الظاهرية بأنماط وراثية معينة.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد أنبوبين من محلول المصفوفة عن طريق إذابة 2.5 ملليغرام من HCCA في 250 ميكرولتر من خليط المذيبات العضوية ، 50٪ إيزنيتريل. أضف الأنسولين البشري المؤتلف كمعايرة داخلية لأحدها ، ثم 47.5٪ ماء مقطر مزدوج و 2.5٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. بعد ذلك ، انشر كمية بحجم رأس الدبوس من المستعمرة من السلالة المرجعية ، مباشرة على لوحة مستهدفة مالدي.

لتحديد الكتلة الدقيقة لذروة المعايرة ، ضعها على ميكرولتر من معيار الاختبار في مكان آخر. قم بتراكب كل بقعة من البكتيريا وقياسها ب 1 ميكرولتر من محلول المصفوفة المسننة HCCA واتركها لتتبلور في درجة حرارة الغرفة. لكل سلالة يتم تحليلها ، كرر تحضير اللطاخة.

قم بتراكب كل بقعة ب 1 ميكرولتر من محلول مصفوفة HCCA المسنن واتركه يتبلور في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك ، يمكن استخراج البروتينات من الخلايا التي يصعب الكذب. لهذا ، قم بحصاد ما يقرب من 5 مستعمرات من ثقافة صفيحة أجار بحلقة تلقيح.

قم بتعليقها في 300 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج في أنبوب تفاعل سعة 1.5 ملليلتر ، واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات المتكررة حتى يتم تعليق المستعمرات البكتيرية تماما. ثم أضف 900 ميكرولتر من الإيثانول المطلق واخلطها. الطرد المركزي العينة عند 13 ، 000 غرام لمدة 1 دقيقة.

بعد تجفيف الحبيبات ، أعد تعليقها عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 70٪. ثم أضف 50 ميكرولترا من الأسيتو النتريل واخلطها. قم بإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي عند 13 ، 000 جم لمدة دقيقتين.

عند الانتهاء ، انقل 1 ميكرولتر من الاسم الكبير إلى موضع عينة على لوحة مستهدفة مالدي. بعد ترك العينة تجف ، قم بتراكب كل بقعة بميكرولتر واحد من محلول مصفوفة HCCA واتركها لتتبلور في درجة حرارة الغرفة. في هذه المرحلة ، قم بإجراء تحليل MALDI-TOF عن طريق جمع 600 طيف في 100 خطوة طلقة لكل نقطة.

أولا ، انقر فوق علامة التبويب التنفيذ التلقائي في برنامج التكوين الخاص بمقياس الطيف الكتلي. افتح الطريقة بالنقر بزر الماوس الأيسر على زر الطريقة واختيار الطريقة من القائمة المنسدلة. بعد ذلك ، انقر بزر الزر الماوس الأيسر فوق الزر "تحرير" لفتح محرر طريقة التنفيذ التلقائي.

ضمن علامة تبويب التراكم، اضبط قيمة اللقطة المرضية على 100 وقيمة المجموع إلى 600. لكل طيف ، اختر ذروة العيار من القائمة ، وانقر فوق التعيين التلقائي "واضغط على موافق" بعد الحصول على أطياف الكتلة من كل بقعة ، حدد تجريبيا الكتلة الدقيقة لذروة المعايرة ، عن طريق فتح طيف باستخدام متصفح الطيف وإيجاد الذروة عند الكتلة المتوقعة مقارنة بالطيف بدون طيف. تأكد من أن ذروة العيار غير محجوبة بواسطة أي علامة حيوية أخرى للكائن الحي المعني.

من بيانات تسلسل الجينوم للسلالة المرجعية ، احسب الوزن الجزيئي أحادي النظير النظري لكل بروتين من البروتينات المشفرة عن طريق ترجمة تسلسل الحمض النووي إلى تسلسل الأحماض الأمينية المقابل. قم بتحميل ملف "أو نسخ لصق" تسلسل البروتين هذا في مربع الإدخال للوحة موارد المعلوماتية الحيوية المناسبة ، واحسب النقطة المتساوية الكهربية النظرية والوزن الجزيئي. انسخ النتائج في جدول بيانات يحتوي على عمود واحد يحتوي على معرف الجين وعمود آخر يحتوي على الوزن الجزيئي.

قم بفرز الصفوف حسب الوزن الجزيئي المحسوب ، لتسهيل البحث عن الكتل. أدخل عمودا إضافيا في جدول البيانات للوزن الجزيئي للنموذج المنزوع ، مع طرح 135 دوتون من الوزن الجزيئي أحادي النظير. قم بتعيين كل كتلة مؤشر حيوي رئيسي مقاسة للكتل المحسوبة من السلالة المرجعية ، من خلال البحث عن الكتلة المقاسة من جدول الجينوم.

في جدول بيانات آخر ، سجل الكتلة والمعرف لكل أيون مؤشر حيوي. الآن قم بمعايرة الأطياف الكتلية التي تم الحصول عليها من عزلات المجموعة كما هو الحال بالنسبة للسلالة المرجعية. بالنسبة لعزل واحد لكل صف ، حدد المؤشرات الحيوية المتغيرة في أطياف الكتلة ، وسجل الكتلة المقاسة لكل مؤشر حيوي والشكل الإسوي المتوقع في الأعمدة المعنية.

يحتوي الطيف الكتلي MALDI-TOF للسلالات C-Jejuni doylei ATCC 49349 على 14 أيونات علامات حيوية مشحونة بشكل فردي يمكن تحديدها من خلال مقارنة الكتل الجزيئية المحسوبة مع الطيف المرجعي. داخل المجموعة ، تم الكشف عن أشكال متميزة متميزة ل L32 بدون الميثيونين ، L33 ، والبروتين الافتراضي المشفر بواسطة gil152939117 و S20 M و S15 M ، وكانت الكتل المتبقية المخصصة لأيونات المؤشرات الحيوية ثابتة في العزلات المختبرة. تم تحديد استبدال الأحماض الأمينية المقابلة لتحول الكتلة عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وتسلسل سانجر للجين المعين باستخدام الاشعال المدرجة هنا.

إلى تسلسل الأحماض الأمينية لجميع أيونات المؤشرات الحيوية المدرجة في مخطط MSPP ، بالإضافة إلى الأشكال الإسوية الأليلية المكتشفة. يظهر مخطط شجيرات UPGMA المستند إلى MLST الذي تم إنشاؤه من عزلات دويلي الفرعية التي تم فحصها من النوع الفرعي C jejuni ، أن كل عزلة تنتمي إلى نوع تسلسل MLST مختلف. والسلالة LMG7790 لها أطول مسافة للتطور التطوري.

كما رأينا مع MLST alaysis ، فإن LMG7790 المعزول لديه أطول مسافة نشوء في تحليل MSPP لعزلات دويلي الفرعية التي تم فحصها من C jejuni. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون يوم واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء اتباع هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر سمية بعض المواد المستخدمة أثناء التجربة.

على سبيل المثال ، يمكن أن يسبب الأسيتو النتريل تهيج الجلد. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسلسل الحمض النووي ل MSPP لتحليل المزيد من المعلمات ، مثل وجود جينات المقاومة. يمهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الأحياء الدقيقة لاستكشاف التطور الضوئي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عمل MSPP وكيف يمكن تطبيقه على أسئلة محددة. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض العنيفة يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل معدات مختبر S2.