الحركية قياس وفي الوقت الحقيقي التصور من إعادة برمجة الجسدية

الهدف العام من هذه الإجراءات هو تصور وتتبع تطور إعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو iPSC. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال iPSC, مثل كيفية تغيير حركية إعادة البرمجة وإعادة برمجة الكفاءات بواسطة الأنسجة الجسدية المستخدمة, تقنيات إعادة البرمجة المطبقة, ومجموعات المصفوفة والوسائط المستخدمة معها. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تستخدم علامات سطح الخلية للنظر في انتقالات الخلايا الجسدية إلى iPSCs بحيث يمكنك استخدام هذه التكنولوجيا لتكون قادرة على مراقبة أحداث إعادة البرمجة في الوقت الفعلي.

في اليوم السابع بعد التنبيغ ، اغسل الخلايا الليفية بملليلترين من DPBS لكل بئر وأضف 0.5 مل من 37 درجة مئوية 05٪ EDTA إلى كل بئر لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند 37 درجة مئوية. عندما يتم تقريب الخلايا ، أوقف التفاعل بملليلترين من وسط الخلايا الليفية 37 درجة مئوية لكل بئر وقم بماصة الوسط برفق عبر قاع كل بئر لإخراج الخلايا. انقل الخلايا الليفية من كل بئر إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 15 مليلتر وجمعها عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الكريات في ملليلترين من وسط الخلايا الليفية الطازجة 37 درجة مئوية وعد الخلايا من كل حالة ثقافة. بعد ذلك ، قم بالبذور مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة في آبار مكيفة مستقلة عن التغذية معدة مسبقا في صفيحة زراعة أنسجة من ستة آبار واحتضان الخلايا المنقولة في حاضنة زراعة الخلايا بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استبدل الوسط الموجود في كل بئر بالوسط المناسب لتطبيق الخلية.

ثم ضع اللوحة في جهاز التصوير واضبط البرنامج لالتقاط صور مستمرة لتباين طور البئر الكامل وصور الفلورسنت لكل بئر كل ست إلى ثماني ساعات لمدة 14 يوما القادمة. في نهاية تجربة إعادة البرمجة ، اغسل الآبار مرة واحدة بمليلترين من وسط 37 درجة مئوية DMEM / F12. تخلص من الغسيل وقم بتسمية الخلايا بمليلتر واحد لكل بئر من الأجسام المضادة الأولية المناسبة في وسط DMEM / F12 الطازج لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين بوسط 37 درجة مئوية DMEM / F12. ثم تخلص من الغسيل وقم بتسمية الخلايا بمليلتر واحد من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في وسط 37 درجة مئوية DMEM / F12 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين أخريين باستخدام وسيط DMEM / F12.

ثم استبدل الغسيل في كل بئر بملليلترين من وسط DMEM / F12 الطازج 37 درجة مئوية. ضع الطبق في جهاز التصوير وافتح برنامج التصوير. لإعداد عمليات المسح الضوئي على برنامج نظام التصوير، حدد أولا موضع الدرج المراد استخدامه وحدد نوع الطبق المراد مسحه ضوئيا.

بعد ذلك ، حدد تصوير البئر الكامل ، ونمط مسح الآبار المرغوبة ، وقنوات الفلورسنت المناسبة لتحديد العلامات السطحية ذات الأهمية في الوقت الفعلي. ثم قم بتسمية التجربة المراد مسحها ضوئيا وقم بتعيين النقاط الزمنية والفواصل الزمنية للعينات المراد مسحها ضوئيا كل يوم. لتحليل مجموعة من التجارب الممسوحة ضوئيا، حدد التجربة ذات الاهتمام وحدد بدء تشغيل مهمة تحليل جديدة.

ثم حدد تعريف المعالجة المناسب لنوع التحليل وفقا للقنوات المستخدمة للتصوير ، على سبيل المثال ، PSC Phase Colony Count. قم بتسمية مهمة التحليل. وحدد النطاق الزمني للتحليل والآبار المراد تحليلها.

ثم قم بتشغيل مهمة التحليل. لقياس النقاط الزمنية المطلوبة لإعادة البرمجة من الآبار الفردية ، اغسل البئر محل الاهتمام مرة واحدة باستخدام ملليلترين من DPBS. ثم استبدل الغسيل بملليلتر واحد من محلول التربسين EDTA الدافئ مسبقا 37 درجة مئوية 05٪.

بعد خمس دقائق من 37 درجة مئوية ، اغسل التربسين على قاع البئر لفصل الخلايا إلى معلق أحادي الخلية ونقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. باستخدام ثلاثة ملليلتر من DPBS ، اغسل أيا من الخلايا المتبقية من البئر واسحبها في أنبوب 15 ملليلترا. أضف 10 مل إضافية من DPBS إلى الخلايا وقم بتدويرها عن طريق الطرد المركزي.

أعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط DMEM / F12 للعد. ثم قم بتخفيف معلق الخلية إلى واحد في عشر الخلايا الست لكل تركيز مليلتر وتناول مليلتر واحد من الخلايا لكل أنبوب للعدد المناسب من العينات. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية في مليلتر واحد من وسط DMEM / F12 لمدة 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الخلط.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين في وسط 37 درجة مئوية DMEM / F12. أعد تعليق الكريات في مليلتر واحد من DPBS ونقل العينات إلى أنابيب FACS فردية. احصل على ملامح قياس التدفق الخلوي للألواح المعاد برمجتها.

ثم انقل ملفات FCS إلى جهاز كمبيوتر وقم باستيراد الملفات إلى برنامج التحليل المناسب. افتح ملف التحكم الأول في مخطط مبعثر للأمام وقم بتعيين المحور y على مقياس لوغاريتمي. ثم قم بإنشاء بوابة متعددة الأضلاع حول السكان الأحياء.

بعد ذلك ، قم بإنشاء منطقة مبعثر جانبية عن طريق مخطط ارتفاع المبعثر باستخدام الخلايا الحية وقم بتعيين بوابة مستطيلة لاستبعاد الزوجيات. ثم استخدم هذه البوابات لتحليل ملفات العينة التجريبية ضمن قنوات الفلورسنت المناسبة لتحديد المجموعات السكانية ذات الأهمية في الأرباع الخاصة بها. تؤدي إعادة برمجة الخلايا الليفية BJ باستخدام فيروسات إعادة برمجة Sendai إلى توليد خلايا SSEA4 + CD44 بمعدل مختلف عن إعادة برمجة الخلايا الليفية DF1 ، مما يدل على أنه يمكن استخدام مقارنة مبكرة للنسبة المئوية للخلايا الجذعية متعددة القدرات الشبيهة بالخلايا الجذعية SSEA4 + CD44 لتتبع تقدم إعادة البرمجة.

في المسار الزمني لقياس التدفق الخلوي ، تشكل الخلايا الليفية CD24-CD44 + و EpCAM السلبية CD44 + مجموعات سكانية سلبية مزدوجة تنتقل لاحقا إلى خلايا شبيهة بالخلايا الجذعية CD44 الإيجابية CD44 و EpCAM على التوالي ، مما يحدد تقدم إعادة البرمجة. يوضح التصوير في الوقت الفعلي لثقافات إعادة البرمجة بعد إعادة البذر تكوين مستعمرة تدريجي يتوافق مع زيادة لوغاريتمية في التقائها ويظهر التعبير النهائي النهائي الإيجابي الموجب والخلايا الليفية السلبية عند الانتهاء من إعادة البرمجة. علاوة على ذلك ، يسمح استخدام جين المراسل بقياس الالتقاء تحت تباين الطور مع زيادة تدريجية أكثر في التقاء GFP الذي لوحظ مقارنة بالالتقاء الكلي.

في الواقع ، في هذه التجربة التمثيلية ، كان التقاء GFP في اليوم 19 أقل من نصف إجمالي التقاء المقابل لإعادة البرمجة الكاملة. بمجرد إتقانها ، يمكن استخدام هذه التقنية لتوضيح المعلومات حول إعادة برمجة الأحداث وتتبع حركية إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية. يمكن أيضا استخدام هذه التقنية للنظر في أنسجة الخلايا الجسدية المختلفة ، وتقنيات إعادة البرمجة المستخدمة ، ومجموعات المصفوفة المتوسطة لتوضيح أحداث إعادة البرمجة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو, يجب أن يكون لديك فهم جيد حول كيفية الاستفادة من المراقبة في الوقت الحقيقي والتعبير عن علامة سطح الخلية, لتكون قادرة على تتبع إعادة برمجة الخلايا الليفية البشرية في iPSCs.