الكشف عن البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي في المختبر RNA المنسدلة في خلية شحمية الثقافة

الهدف العام من هذه التجربة هو استرداد البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي لنسخة الحمض النووي الريبي من الأنسجة الدهنية البنية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في هذا المجال ، مثل ، ما هي الآليات التنظيمية للحمض النووي الريبي طويل العمر ، وبروتينات الحمض النووي الريبي المرتبطة بها. الميزة الرئيسية لهذا التكتيك هي أنه سهل الأداء.

الحمض النووي الريبي المستخدم لإثبات هذا الإجراء هو جزء من المنطقة غير المترجمة لمستقبلات المستضد 3-Prime ، والتي يشار إليها فيما يلي باسم AR 3-Prime UTR. ابدأ بتضخيم T7 AR oligo والتسلسل الجزئي للحمض النووي لوسيفيراز اليراع من البلازميد psiCHECK-2. تم تفصيل الاشعال والمعلمات المستخدمة في المستند المصاحب.

بعد التضخيم ، استخدم منتجات PCR كقوالب لتصنيع الحمض النووي الريبي الحيوي باستخدام مجموعة نسخ في المختبر ، باتباع تعليمات الشركات المصنعة. ثم احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد النسخ في المختبر ، أضف ميكرولتر واحدا من Dnase إلى التفاعل واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتحلل الحمض النووي للقالب.

ثم ارفع الحجم الإجمالي إلى 60 ميكرولتر بالماء. ضع الحمض النووي الريبي الحيوي على أعمدة التنقية لإزالة الملح والنيوكليوتيدات غير المدمجة. بعد ذلك ، بعد قياس تركيز الحمض النووي الريبي ، قم بتخزين RNase عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لإجراء فحوصات منسدلة لاحقة.

في يوم الفحص ، قم بإذابة الحمض النووي الريبي الحيوي المجمد على الجليد. بعد ذلك ، للتأكد من أن الحمض النووي الريبي المعني لديه الهيكل الثانوي المناسب ، قم بتسخين 50 ميكرولترا منه عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين. يبرد على الثلج لمدة دقيقتين.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت لهيكل الحمض النووي الريبي 2X واسمح للحمض النووي الريبي بالطي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتعليق الخرز المغناطيسي المطلي بالستربتافيدين في قارورتها الأصلية عن طريق دوامها لفترة وجيزة. ثم انقل 150 ميكرولترا من الخرزات المعلقة إلى أنبوب سعة 1.5 مل.

ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة لفصل الخرز المغناطيسي عن المادة الطافية. استخدم ماصة لإزالة المادة الطافية والتخلص منها. احتفظ بحبيبات الخرزة.

اغسل الخرزات مرة واحدة عن طريق تعليق حبيبات الخرزة في مليلتر واحد من المخزن المؤقت الموصى به للتصنيع والغسيل 1X ، ثم ضع الأنبوب على جهاز تدوير لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل بالمخزن المؤقت A والمخزن المؤقت B مرتين. بعد الحضانة ، تخلص من المادة الطافية واحتفظ بحبيبات الخرزة.

بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخرزة في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل والربط 2X. قسم الخرزات بالتساوي إلى ثلاثة أنابيب سعة 1.5 ملليلتر مع 100 ميكرولتر من الخرز لكل أنبوب. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، و 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لوسيفيراز اليراع البيوتينيل و 100 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي AR 3-Prime UTR الحيوي.

احتضان كل خليط حبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع التناوب. ثم ضع الأنابيب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.

احتفظ بحبيبات الخرز. بعد ذلك ، اغسل الخرزات مرتين ، في كل مرة قم بتعليق حبيبات الخرزة ب 400 ميكرولتر من 1X الغسيل والربط المؤقت ، ثم ضعها على التدوير لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب على مغناطيس لمدة دقيقة واحدة.

ثم قم بإزالة والتخلص من كل المادة الطافية. أعد تعليق كل حبيبات حبة في 50 ميكرولتر من عازلة العزل النووي. استعدادا للجزء التالي من البروتوكول ، تأكد من تبريد جميع المخازن المؤقتة ، بالإضافة إلى المجانسات الزجاجية المتساقطة على الجليد.

يجب أن يستمر تحضير محللة الخلية على الجليد. لكل اختبار منسدل للحمض النووي الريبي يتم إجراؤه ، قم بإعداد طبق واحد بطول 15 سم من الخلايا الشحمية المتمايزة من الفئران البرية C57 Black Six البالغة من العمر ثلاثة أسابيع. بعد أربعة إلى خمسة أيام ، لحصاد الخلايا ، أضف 10 إلى 15 مل من PBF ثم استخدم مكشطة خلية لإزالة الخلايا من الطبق.

انقلها إلى أنبوب سعة 50 مليلتر ثم قم بتكويرها عن طريق الطرد المركزي عند 200 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران، استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لشفط المادة الطافية والتخلص منها. بعد ذلك ، أعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلترين من المخزن المؤقت منخفض التوتر واحتضان الخلايا على الجليد لمدة خمس عشرة دقيقة.

انقل الخلايا إلى الخالط الزجاجي سعة 15 مليلتر وقم بقص الخلايا ميكانيكيا على الجليد ب 20 ضربة. حبيبات نوى الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 3300 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، انقل المادة الطافية إلى أنابيب سعة 1.5 مليلتر واحتفظ بالحبيبات على الجليد لاستخدامها لاحقا.

أضف كلوريد البوتاسيوم 3 مولار إلى المادة الطافية للحصول على تركيز نهائي يبلغ 150 ملليمولار. تدور عند 20،000 مرة جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، ستكون هناك طبقة دهنية في الأعلى.

استخدم ماصة سعة ملليلتر واحد لإزالتها بعناية. ثم اجمع المادة الطافية المحللة الخلوية السيتوبلازمية. بعد ذلك ، باستخدام ماصة سعة مليلتر واحد ، أعد تعليق حبيبات النوى في مليلتر واحد من مخزن العزل النووي وانقله إلى الخالط الزجاجي سعة 15 ملليلترا.

قص النوى ميكانيكيا على الجليد ب 100 ضربة. حبيبات الحطام النووي عن طريق الطرد المركزي عند 20,000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اجمع المادة الطافية مثل التحلل الخلوي النووي.

يمكن دمجها مع المحللة السيتوبلازمية التي تم جمعها مسبقا أو الاحتفاظ بها منفصلة للتطبيقات اللاحقة. هنا ، يتم دمج العينات بنسبة واحد إلى واحد. أضف مثبط RNase إلى محللة الخلية غير المجزأة للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.5 وحدة لكل ميكرولتر.

بعد ذلك ، ضع جانبا 100 ميكرولتر من محللة الخلية على الجليد كعنصر تحكم في الإدخال للنشاف الغربي. قسم محللة الخلية إلى ثلاثة حصص متساوية مع مليلتر واحد من محللة الخلية في كل أنبوب سعة 1.5 مليلتر واحتضانه مع حبات الحمض النووي الريبي لوسيفيراز اليراع الفارغة والخرز المترافق AR 3-Prime UTR ، على التوالي ، لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية مع الدوران. بعد الحضانة ، ضع الأنابيب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة.

استخدم ماصة سعة مليلتر واحد لجمع المادة الطافية ، ثم عزل الحمض النووي الريبي وتقييم سلامة الحمض النووي الريبي كما هو موضح في المستند المصاحب. احتفظ بحبيبات الخرز على الثلج. اغسل الخرزات المغناطيسية ست مرات.

في كل مرة ، قم بتعليق حبيبات الخرزة في مليلتر واحد من المخزن المؤقت للعزل النووي الذي يحتوي على 40 وحدة من مثبط RNase و 0.25 في المائة من الإيجيبال. قم بتدوير الأنابيب لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي لفصل الخرز المغناطيسي والمادة الطافية.

بعد دقيقة واحدة ، قم بالشفط والتخلص من المادة الطافية ، ثم ضع حبيبات الخرز على الثلج. لتصفية مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي من الخرزات للنشاف الغربي ، أولا ، قم بإعادة تعليق كل حبة حبة في 75 ميكرولترا من المخزن المؤقت للعزل النووي. ثم أضف 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحميل اللطخة الغربية 4X.

تحتوي على SDS ، للحصول على حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر. أخيرا ، قم بغلي الخرز في هذا المحلول سعة 100 ميكرولتر عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإجراء نشاف غربي للتحقق من RBP كما هو موضح في المستند المصاحب.

في هذه التجربة ، تم استخدام جزء من الحمض النووي الريبي لمستقبلات المستضد كطعم لالتقاط بروتين الارتباط ، HuR. كان كل من طعم الحمض النووي الريبي لوسيفيراز اليراع غير المرتبط ببروتين HuR وكمية من حبات الستربتافيدين الفارغة غير المقترنة بمثابة عناصر تحكم سلبية. يمكن أن تحدث تفاعلات بروتين الحمض النووي الريبي إما في النواة أو السيتوبلازم ، ويمكن تطبيق هذا البروتوكول المنسدل على محللات الخلايا النووية أو السيتوبلازمية الكلية أو المجزأة.

أظهر التحليل بواسطة النشاف الغربي بروتين HuR في محللة الخلية غير المجزأة ، أو المدخلات ، باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة. أعطى جزء التخلص من الحمض النووي الريبي لمستقبلات المستضد أيضا نتيجة إيجابية ، مما يشير إلى وجود بروتين HuR في محللة الخلايا الشحمية باستخدام حبات مستقبلات المستضد المترافقة بالحمض النووي الريبي لمقايسة الحمض النووي الريبي المنسدل. أعطى كل من جزء شطف الحمض النووي الريبي لوسيفيراز اليراع وعينة الخرزة الفارغة نتائج سلبية ، مما يشير إلى أن التفاعلات غير المحددة لم تكن قابلة للاكتشاف باستخدام هذا النهج.

مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن التفاعل بين جزء الحمض النووي الريبي لمستقبلات المستضد وبروتين HuR كان محددا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استرداد بروتينات ربط الحمض النووي الريبي من نسخة الحمض النووي الريبي من الأنسجة الدهنية البنية. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بذلك في غضون 24 ساعة ، إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.