عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعتين منفصلتين من الخلايا السلفية حول الوعائية متعددة القدرات من أنسجة القلب البشرية. قد تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال تجديد القلب، مثل المساهمة التي تقدمها مجموعات فرعية من مجتمع الخلايا حول الوعائية في هذه العملية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تؤدي إلى الحصول على مجموعات من الخلايا السلفية ذات تباين منخفض وحيوية محسنة مقارنة بمجموعة من تقنيات إزالة الالتصاق الرئيسية.

قد تكون لهذه التقنية تداعيات في علاج مرض القلب الإقفاري لأن الأنواع الفرعية من الخلايا الجذعية المحيطة بالأوعية قد أظهرت قدرة على تكوين خلايا عضلة القلب. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية معمقة حول دور الخلايا المحيطة بالأوعية في تجديد القلب، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً في استقصاء جوانب أخرى من أمراض القلب، مثل تليف عضلة القلب. وبشكل عام، قد يواجه الأفراد المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب استخدام الخلايا الحية التي تتطلب نضارة الأنسجة.

لبدء هذا الإجراء، بعد إزالة التأمور والأوعية الدموية الرئيسية والأذينين، ضع العينة في وسط الغسيل داخل طبق بتري. بعد ذلك، قم بتقطيع عضلة البطين إلى قطع صغيرة بحجم واحد مليمتر مكعب تقريبًا، وقم بمعالجتها على الفور للحصول على أعلى عائد من الخلايا. ثم، قم بتحضير محلول هضم طازج ودفئه إلى 37 درجة Celsius في حمام مائي.

بعد ذلك، يتم ترشيح قطع الأنسجة المعلقة باستخدام مصفاة بمسام 100 micron وتُغسل مرتين باستخدام PBS. تُنقل قطع الأنسجة إلى حاوية معقمة سعة 30 milliliter ذات غطاء محكم الغلق. يُضاف محلول الهضم وتوضع الحاوية داخل كيس بلاستيكي مغلق في حمام مائي هزاز عند درجة حرارة 37 degrees Celsius وبسرعة 120 RPM.

بعد مرور 15 دقيقة، قم بقلب الحاوية ثلاث مرات. ثم، أعدها إلى الحمام المائي لمدة 15 دقيقة إضافية. بعد ذلك، قم بإخراجها وإيقاف نشاط الكولاجيناز باستخدام خمسة مليلترات من وسط DMEM المكمل بـ 20% FBS.

بعد ذلك، يتم سحق النسيج المهضوم عن طريق السحب والضخ بلطف بواسطة ماصة سيرولوجية سعة 10 ملليلتر من 10 إلى 20 مرة لتفتيت أي تكتلات نسيجية. ثم يتم ترشيح المعلق بالتتابع عبر مصفاة خلايا بمسامية 100 ميكرون، ثم 70 ميكرون، وأخيراً 40 ميكرون للحصول على معلق من الخلايا المفردة. عقب ذلك، يتم طرد معلق الخلايا مركزياً عند 200 x g لمدة أربع دقائق.

قم بسكب السائل الطافي بعناية وأعد تعليق الراسب في 1 milliliter من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة قبل تخفيفه بـ 4 milliliters من وسط الغسيل. كرر خطوة الطرد المركزي وأعد تعليق الراسب في 1 milliliter من وسط الغسيل. خفف 10 microliters من معلق الخلايا مع 90 microliters من وسط الغسيل لتحضير تخفيف لمعلق الخلايا بنسبة 1 إلى 10.

اخلط 10 µL من معلق الخلايا المخفف مع 10 µL من صبغة trypan blue، وضع 10 µL من الخليط على مقياس كرات الدم (hemocytometer) قياسي لعد الخلايا. في هذا الإجراء، أضف 50 µL من مصل الفئران إلى معلق الخلايا واحضنه في درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة لمنع الارتباط غير النوعي للأجسام المضادة. بعد ذلك، قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا بسرعة 200 x g لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في وسط الغسيل. بعد ذلك، قم بتوزيع 50 µL من معلق الخلايا في كل من أنبوبي قياس التدفق الخلوي المصنوعين من البوليسترين ذوي القاع المستدير، وذلك للضوابط من النوع المتماثل (isotype) والضوابط غير المصبوغة، وضع الحجم المتبقي في أنبوب ثالث للتلوين متعدد الألوان. أضف خمسة أجسام مضادة إلى معلق الخلايا الفردية من أجل التلوين متعدد الألوان.

استخدم الماصة للمزج برفق بين الأجسام المضادة والخلايا، ثم حضّن جميع الأنابيب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة في الظلام. قم بتحضير حبيبات التحكم في التعويض عن طريق إضافة قطرة واحدة من الحبيبات الموجبة إلى 100 µL من وسط الغسيل في خمسة أنابيب خاصة بالتدفق الخلوي. أضف الأجسام المضادة بشكل فردي إلى كل أنبوب من الأنابيب الخمسة.

بعد ذلك، قم بحضن جميع الأنابيب عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة في الظلام. وفي هذه الأثناء، قم بتجهيز أنابيب جمع الخلايا، بحيث يحتوي كل منها على 500 µL من وسط استزراع EGM-2، وضعها عند درجة حرارة 4 °C. وبعد الانتهاء من حضن الأجسام المضادة، أضف 5 mL من وسط الغسيل لغسل الخلايا والخرز من أجل إزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة.

قم بطرد مركزي لجميع الأنابيب عند 200 x g لمدة أربع دقائق. كرر خطوات الغسيل والطرد المركزي ثم قم بسكب السائل الطافي بعناية. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في وسط الغسيل بتركيز 1 × 10⁶ خلية لكل 250 µL.

بعد ذلك، أعد تعليق الحبيبات في 100 µL من وسط الغسيل. انقل معلقات الخلايا والحبيبات إلى جهاز فرز الخلايا على الثلج وفي الظلام. أضف قطرة واحدة من الحبيبات السالبة إلى أنابيب التحكم في تعويض الحبيبات الموجبة، واستخدم هذه الأنابيب لضبط تعويض الفلورة.

بعد ذلك، يتم تشغيل الخلايا الضابطة غير المصبوغة لتحديد الفلورة الخلفية وضبط الجهود الكهربائية. تلي ذلك خطوة تشغيل النظائر الضابطة (control isotypes) لتحديد عتبات الفلورة الخلفية المتعلقة بالارتباط غير النوعي. أخيراً، يتم تشغيل العينة المصبوغة بعدة ألوان وجمع مجتمعات الخلايا الحولية (pericyte) والخلايا الغمدية (adventitial cell) في أنابيب الجمع.

في هذا الإجراء، أضف 100 µL من محلول الجيلاتين المعقم بتركيز 0.2% لكل سنتيمتر مربع من مساحة النمو، ورجّ الأطباق يدويًا لطلاء جميع الآبار بالكامل. بعد ذلك، قم بتحضين الأطباق عند درجة حرارة 4 °C لمدة 10 دقائق. ثم أزل محلول الجيلاتين تمامًا.

احتفظ بالخلايا المجمعة على الثلج أثناء تحضير أطباق الزرع. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا المجمعة حديثاً مركزياً عند 200 x g لمدة أربع دقائق، وأعد تعليق كتلة الخلايا المترسبة بلطف في كمية مناسبة من EGM-2. بعد ذلك، قم بزراعة الخلايا على الأطباق المطلية بالجيلاتين.

في هذا الشكل، تم إجراء تحديد بوابات (gating) للخلايا الحية لاستبعاد الخلايا الموجبة لـ CD45 أولاً، تليها الخلايا الموجبة لـ CD56. بعد ذلك، تم استبعاد الخلايا البطانية الموجبة لـ CD144 من الجزء السالب لـ CD56. ومن هذه المجموعة النهائية، تم اختيار وجمع الخلايا الحولية (pericytes) الموجبة لـ CD146 والسالبة لـ CD34، والخلايا البرانية (adventitial cells) السالبة لـ CD146 والموجبة لـ CD34.

تظهر كلتا المزرعتين من الخلايا الحولية العضلية القلبية (myocardial pericytes) والخلايا الغمدية (adventitial cells) المنقاة بواسطة تقنية FACS شكلاً خلوياً يتراوح بين المغزلي والنجمي. وبمجرد إتقان هذه التقنية، ستستغرق حوالي خمس ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن العينات الأكثر حداثة ستوفر أفضل عائد من الخلايا الحية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل تشكيل عضلة القلب الخلوية، للإجابة على أسئلة إضافية، مثل مدى ملاءمة هذه الخلايا في علاج مرض نقص تروية القلب.