عزل بالسكان خلية حول الأوعية متعددة القدرات السلائف من قلب الإنسان الأنسجة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل مجموعتين منفصلتين من الخلايا السليفة المحيطة بالأوعية الدموية متعددة القدرات من أنسجة القلب البشري. قد تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تجديد القلب ، مثل المساهمة المقدمة في هذه العملية من قبل مجموعات فرعية من مجموعات الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تؤدي إلى انخفاض عدم التجانس في مجموعات الخلايا السلفية وتحسين قابلية البقاء لمجموعة مختارة من تقنيات الالتصاق السابقة الرئيسية.

هذه التقنية لها آثار في علاج أمراض القلب الإقفارية لأن الأنواع الفرعية للخلايا الجذعية حول الأوعية الدموية قد ثبت أن لديها إمكانات عضلة القلب. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لدور الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية في تجديد القلب ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على التحقيق في جوانب أخرى من أمراض القلب ، مثل تليف عضلة القلب. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب استخدام الخلايا القابلة للحياة نتيجة لنضارة الأنسجة.

لبدء هذا الإجراء ، بعد إزالة التامور والأوعية الرئيسية والأذينين ، ضع العينة في وسط الغسيل في طبق بتري. بعد ذلك ، قم بتقطيع عضلة القلب البطينية إلى قطع صغيرة من حوالي ملليمتر مكعب واحد ومعالجتها على الفور للحصول على أعلى إنتاجية للخلايا. ثم اصنع محلول هضم طازج وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.

بعد ذلك ، قم بتصفية قطع المناديل المعلقة من خلال مصفاة 100 ميكرون واغسلها مرتين باستخدام PBS. انقل قطع المناديل إلى وعاء معقم سعة 30 مليلتر بغطاء محكم الإغلاق. أضف محلول الهضم وضع الحاوية داخل كيس بلاستيكي محكم الغلق في حمام مائي مهتز 37 درجة مئوية مضبوطا على 120 دورة في الدقيقة.

بعد 15 دقيقة ، اقلب الحاوية ثلاث مرات. ثم ضعه مرة أخرى في الحمام المائي لمدة 15 دقيقة إضافية. بعد ذلك ، قم بإزالة وإخماد الكولاجيناز بخمسة ملليلتر من DMEM مكمل بنسبة 20٪ FBS.

بعد ذلك ، قم بتقطيع الأنسجة المهضومة عن طريق سحب الأنسجة برفق من 10 إلى 20 مرة باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر لتحطيم أي كتل أنسجة. بعد ذلك ، قم بتصفية التعليق بالتتابع من خلال مصافي خلية 100 ميكرون و 70 ميكرون وأخيرا 40 ميكرون للحصول على تعليق خلية واحدة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة أربع دقائق.

صب المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من محلول الخلايا الحمراء لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة قبل تخفيفها بأربعة ملليلتر من وسط الغسيل. كرر خطوة الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط الغسيل. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 90 ميكرولتر من وسط الغسيل لعمل تخفيف من واحد إلى 10 من تعليق الخلية.

امزج 10 ميكرولترات من معلق الخلية المخفف مع 10 ميكرولترات من صبغة التريبان الزرقاء وضع 10 ميكرولترات من الخليط على مقياس كثافة الدم القياسي لعد الخلايا. في هذا الإجراء ، أضف 50 ميكرولترا من مصل الفأر إلى معلق الخلية واحتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة لمنع ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة أربع دقائق.

قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليقها في وسط الغسيل. بعد ذلك ، قم بنقل 50 ميكرولترا من تعليق الخلية في كل من أنبوبي قياس التدفق الخلوي السفليين المستديرين من البوليسترين للنمط المتماثل وعناصر التحكم غير الملوثة ووضع الحجم المتبقي في أنبوب ثالث للتلوين متعدد الألوان. أضف خمسة أجسام مضادة إلى تعليق الخلية المفردة لتلوين متعدد الألوان.

قم بربط الماصة برفق لخلط الأجسام المضادة مع الخلايا واحتضان جميع الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. قم بإعداد حبات التحكم في التعويض عن طريق إضافة قطرة واحدة من الخرز الموجب إلى 100 ميكرولتر من وسط الغسيل في خمسة أنابيب لقياس التدفق الخلوي. أضف الأجسام المضادة بشكل فردي إلى كل أنبوب من الأنابيب الخمسة.

ثم احتضان جميع الأنابيب عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة في الظلام. في غضون ذلك ، قم بإعداد أنابيب تجميع الخلايا ، كل منها يحتوي على 500 ميكرولتر من وسط استزراع EGM-2 ، وضعها عند أربع درجات مئوية. بعد حضانة الأجسام المضادة ، أضف خمسة ملليلتر من وسط الغسيل لغسل الخلايا والخرز لإزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة.

جهاز الطرد المركزي جميع الأنابيب عند 200 × جم لمدة أربع دقائق. كرر خطوات الغسيل والطرد المركزي وصب المادة الطافية بعناية. ثم أعد تعليق الخلايا في وسط الغسيل بتركيز واحد في 10 إلى الخلايا السادسة لكل 250 ميكرولتر.

بعد ذلك ، قم بتعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من وسط الغسيل. انقل معلقات الخلية والخرز إلى فارز الخلايا على الجليد في الظلام. أضف قطرة واحدة من الخرزات السالبة إلى أنابيب التحكم في تعويض الخرزة الموجبة واستخدمها لضبط تعويض التألق.

بعد ذلك ، قم بتشغيل خلايا التحكم غير الملوثة لإنشاء مضان الخلفية وضبط الفولتية. بعد ذلك ، قم بتشغيل الأنماط التماثلية للتحكم لإنشاء عتبات مضان الخلفية المتعلقة بالارتباط غير المحدد. قم بتشغيل العينة الملطخة بألوان متعددة وجمع الخلايا العضاقية والخلايا العرضية في أنابيب التجميع.

في هذا الإجراء ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين المعقم 0.2٪ لكل سنتيمتر مربع من مساحة النمو وقم بتحريكه يدويا لتغطية الآبار بأكملها. بعد ذلك ، احتضن الأطباق على أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم قم بإزالة محلول الجيلاتين تماما.

احتفظ بالخلايا المجمعة على الجليد أثناء تحضير ألواح الاستزراع. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للخلايا التي تم جمعها حديثا عند 200 × جم لمدة أربع دقائق وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق بكمية مناسبة من EGM-2. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا على الألواح المطلية بالجيلاتين.

في هذا الشكل ، تم بوابات الخلايا الحية لاستبعاد الخلايا الإيجابية CD45 أولا تليها الخلايا الإيجابية CD56. ثم تمت إزالة الخلايا البطانية الإيجابية CD144 من الجزء السلبي CD56. من هذه المجموعة النهائية ، تم اختيار الخلايا المحيطية الإيجابية CD146 والسلبية CD34 والخلايا العرضية CD146 السلبية وإيجابية CD34 وجمعها لاحقا.

تظهر كلتا الثقافتين من خلايا عضلة القلب المنقاة والخلايا العرضية مغزل لتشكل الخلايا النجمية. بمجرد إتقانها ، ستستغرق هذه التقنية حوالي خمس ساعات ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن العينات الطازجة ستوفر أفضل إنتاجية للخلايا القابلة للحياة.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل رأب عضلة القلب الخلوي ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل ملاءمة هذه الخلايا في علاج أمراض القلب الإقفارية.