طريقة سريعة والمبسطة لارتفاع العزلة من خلال وضع-من ميرنا من نظافة البروتين الدهني عالي الكثافة

الهدف العام من هذه الطريقة هو تطوير نهج مبسط لعزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة المنقاة بسرعة من بلازما الدم البشري لتحليل الحمض النووي الريبي الدقيق. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أمراض الكبد وأمراض القلب ، مثل فهم الآليات الجزيئية والوظائف الوقائية للبروتينات الدهنية عالية الكثافة. تتمثل بعض المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الحمض النووي الريبي الصغير HDL المنقى يأتي معزولا مسبقا من حجم أقل من العينات في غضون فترة زمنية قصيرة.

في هذا البروتوكول ، يتم الحصول على البلازما من عينات الدم الوريدية المحيطية الصائمة بخطوات طرد مركزي متعددة كما هو موضح في نص البروتوكول. انقل البلازما إلى أنبوب جديد. وقياس كثافة البلازما باستخدام مقياس الكثافة في درجة حرارة الغرفة ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

لإزالة الإكسوسومات المنتشرة التي تمثل مصدرا لتلوث الحمض النووي الريبي الصغير ، أضف 252 ميكرولترا من محلول ترسيب الإكسوسوم إلى مليلتر واحد من البلازما. واحتضان لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم قم بالطرد المركزي للخليط لمدة 30 دقيقة لإخراج الإكسوسوم.

انقل ملليلترا واحدا من المادة الطافية الناتجة إلى أنبوب طرد مركزي فائق سميك من البولي كربونات لمزيد من المعالجة ، كما هو موضح في مقطع الفيديو التالي. يتم عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة ، أو HDL ، من خلال بروتوكول طرد مركزي فائق تدرج الكثافة من ثلاث خطوات ، والذي يتضمن عزلا متسلسلا للبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة جدا ، أو VLDL ، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة ، أو LDL ، و HDL. يجب تحضير حلول الكثافة الثلاثة المختلفة ، A و B و C ، طازجة ، باتباع الإجراء الموضح في نص البروتوكول.

في أنبوب طرد مركزي فائق الجدران سميك سعة 6.5 مليلتر من البولي كربونات ، امزج ملليلترا واحدا من البلازما و 200 ميكرولتر من الدهون الحمراء 7B الخالية من النوكلياز. ثم ضع طبقة بعناية خمسة ملليلتر من المحلول A فوق الخليط. إذا لزم الأمر ، أضف Fat Red 7B إضافيا أعلى المحلول A لموازنة وزن كل أنبوب.

قم بتحميل الأنابيب في دوار مبرد مسبقا. ضع الدوار في جهاز طرد مركزي أرضي وجهاز طرد مركزي لمدة ساعتين. في نهاية الجري ، يجب أن تكون طبقتان مرئيتين.

قم بإزالة 1.5 مل من الطبقة العليا ، والتي تمثل جزء VLDL. وتخزينه أربع درجات مئوية. استخدم ماصة لنقل أربعة ملليلتر من قاع الأنبوب إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.

يحتوي هذا على جزء LDL و HDL. الخطوة التالية هي عزل LDL. امزج ملليلترين من المحلول B و 100 ميكرولتر من Fat Red 7B الخالي من النوكلياز في الأنبوب الذي يحتوي على جزء LDL و HDL.

ضعيها على الثلج لمدة خمس إلى عشر دقائق. انقل 6.5 مل من العينة المختلطة إلى أنبوب طرد مركزي فائق الجدران سميك من البولي كربونات. قم بتحميل الأنبوب في دوار مبرد مسبقا وجهاز طرد مركزي لمدة ثلاث ساعات.

عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة 1.5 مل من الطبقة العليا ، التي تمثل جزء LDL واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية. انقل أربعة ملليلتر من قاع الأنبوب ، الذي يحتوي على جزء HDL إلى أنبوب معقم سعة 50 ملليلترا. الخطوة الثالثة هي عزل HDL.

امزج ملليلترين من المحلول C و 100 ميكرولتر من الدهون الحمراء الخالية من النوكلياز 7B و 15 ميكرولترا من 98٪ بيتا ميركابتو إيثانول في الأنبوب الذي يحتوي على جزء HDL. تحقق من كثافة الخليط. قم بتحميل الأنبوب في دوار مبرد مسبقا وجهاز طرد مركزي لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك ، قم بإزالة ملليلترين من الطبقة العليا ، التي تمثل جزء HDL ، واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية. يجب إزالة الملح الزائد من أجزاء البروتين الدهني لتجنب التداخل مع الرحلان الكهربائي اللاحق لهلام الاغاروز و PCR. في هذا الفيديو، سيتم توضيح تحلية المياه والتركيز لجزء البروتين الدهني عالي الكثافة فقط.

أضف 13 مل من PBS البارد إلى جزء HDL وانقله إلى جهاز مرشح الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 10K. جهاز طرد مركزي في دوار دلو متأرجح ، عند 4000 مرة جم ، وأربع درجات مئوية ، لمدة 30 دقيقة. قم بتحلية جزء HDL ، للمرة الثانية ، باستخدام 13 مل من PBS البارد ، والطرد المركزي كما كان من قبل.

بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة البروتين الدهني المحتوي على المواد المذابة ، واحتفظ بها عند أربع درجات مئوية. لتقييم جودة ونقاء البروتينات الدهنية المعزولة ، تم إجراء الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز مع معايير البروتين الدهني البشري ، المدرجة كمرجع للحجم. أظهرت النتائج التمثيلية من العزل ، بدون بيتا ميركابتو إيثانول ، أن جزء HDL خال من أي تلوث ل VLDL ويظهر حركة ألفا نموذجية.

ومع ذلك ، يظهر جزء HDL أيضا آثارا لحركة بيتا بسبب التلوث بالبروتينات الدهنية. إن إضافة بيتا ميركابتو إيثانول إلى المحلول C ، خلال خطوة الطرد المركزي الأخيرة ، يزيل بشكل فعال جميع البروتينات الدهنية الملوثة من جزء HDL. لإثبات جدوى القياس الكمي للحمض النووي الريبي الصغير ، المحمول في HDL البشري ، المنقى بهذه الطريقة ، تم تضخيم اثنين من الحمض النووي الريبي الصغير المختلف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي.

في مخططات التضخيم هذه ، تمثل الخطوط الأفقية عتبة الكشف. أظهرت بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي التمثيلية من HDL المعزول ، والتي تم الحصول عليها من ست عينات ، اكتشافا متسقا لكل من الحمض النووي الريبي الصغير. أخيرا ، تظهر تحليلات منحنى الذوبان بوضوح ذروة واحدة مميزة لكل من الحمض النووي الريبي الصغير ، بما يتفق مع التضخيم المحدد في تفاعل البوليميراز المتسلسل السابق.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في تسع ساعات ، جنبا إلى جنب مع إجراءات تحلية المياه ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم العمل عند أربع إلى ثماني درجات مئوية ، في جميع الأوقات. ولضبط كثافة كل جزء من البروتين الدهني قبل الطرد المركزي الفائق.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل المجهر الإلكتروني ، من أجل الإجابة على أسئلة إضافية ، مثل نقاء HDL. بعد تطويرها ، ستسمح هذه التقنية للباحثين ، في مجال متلازمة التمثيل الغذائي ، باستكشاف الحمض النووي الريبي الصغير المرتبط ب HDL كعلامات حيوية ، في البشر المشتبه في إصابتهم بمرض الكبد الدهني. يمكن استخدامه أيضا لفهم وظيفة HDL والآليات الجزيئية التي يغير بها بيولوجيا الخلية بشكل أفضل.