طريقة سريعة والمبسطة لارتفاع العزلة من خلال وضع-من ميرنا من نظافة البروتين الدهني عالي الكثافة

الهدف العام من هذه الطريقة هو تطوير نهج مبسط لعزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة المنقاة بسرعة من بلازما الدم البشرية لتحليل الـ micro RNA. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في أمراض الكبد وأمراض القلب، مثل فهم الآليات الجزيئية والوظائف الحمائية للبروتينات الدهنية عالية الكثافة. وتتمثل بعض المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الـ micro RNA الخاص بـ HDL المنقى يتم عزله مسبقاً من حجم عينات أقل وفي فترة زمنية قصيرة.

في هذا البروتوكول، يتم الحصول على البلازما من عينات دم وريدي محيطي مأخوذة من مرضى صائمين عبر خطوات طرد مركزي متعددة كما هو موضح في نص البروتوكول. انقل البلازما إلى أنبوب جديد، ثم قس كثافة البلازما باستخدام مقياس الكثافة في درجة حرارة الغرفة، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

لإزالة الإكسوزومات الجارية التي تمثل مصدراً لتلوث micro RNA، أضف 252 µL من محلول ترسيب الإكسوزومات إلى 1 mL من البلازما، ثم حضن المزيج لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، قم بطرد المزيج مركزياً لمدة 30 دقيقة لترسيب الإكسوزومات.

انقل 1 mL من السائل الطافي الناتج إلى أنبوب طرد مركزي فائق جدرانه سميكة ومصنوع من البوليكربونات لمزيد من المعالجة، كما هو موضح في مقطع الفيديو التالي. يتم إنجاز عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة، أو HDL، من خلال بروتوكول طرد مركزي فائق بتدرج الكثافة مكون من ثلاث خطوات، يتضمن عزلاً تتابعياً للبروتينات الدهنية ذات الكثافة المنخفضة جداً، أو VLDL، والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة، أو LDL، والبروتينات الدهنية عالية الكثافة، HDL. يجب تحضير محاليل الكثافة الثلاثة المختلفة، A و B و C، طازجة، باتباع الإجراء الموصوف في نص البروتوكول.

في أنبوب طرد مركزي فائق من البولي كربونات جدرانه سميكة سعة 6.5 milliliter، اخلط one milliliter من البلازما و 200 microliters من Fat Red 7B الخالي من النيوكلياز. بعد ذلك، أضف بعناية five milliliters من المحلول A فوق الخليط في طبقة. وإذا لزم الأمر، أضف كمية إضافية من Fat Red 7B فوق المحلول A لموازنة وزن كل أنبوب.

ضع الأنابيب في دوّارة مبردة مسبقاً. ضع الدوّارة في جهاز طرد مركزي أرضي وقم بإجراء عملية الطرد المركزي لمدة ساعتين. في نهاية التشغيل، يجب أن تكون هناك طبقتان مرئيتان.

قم بإزالة 1.5 milliliters من الطبقة العلوية، والتي تمثل جزء VLDL، واحفظها في درجة حرارة أربعة degrees Celsius. استخدم ماصة لنقل أربعة milliliters من قاع الأنبوب إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliters.

يحتوي هذا على جزء LDL وHDL. الخطوة التالية هي عزل LDL. اخلط 2 mL من المحلول B و100 µL من Fat Red 7B الخالي من النوكلياز في الأنبوب الذي يحتوي على جزء LDL وHDL.

يُوضع على الثلج لمدة تتراوح من خمس إلى عشر دقائق. يُنقل 6.5 milliliters من العينة المخلوطة إلى أنبوب طرد مركزي فائق الجودة من البولي كربونات ذي جدار سميك. يُوضع الأنبوب في دوّار مبرد مسبقاً ويُجرى الطرد المركزي لمدة ثلاث ساعات.

عند اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بإزالة 1.5 milliliters من الطبقة العلوية، والتي تمثل جزء LDL، واحفظها في درجة حرارة أربع درجات Celsius. انقل أربعة milliliters من قاع الأنبوب، والتي تحتوي على جزء HDL، إلى أنبوب معقم سعة 50 milliliters. الخطوة الثالثة هي عزل HDL.

امزج مليليترين من المحلول C، و100 ميكرولتر من Fat Red 7B الخالي من النوكلياز، و15 ميكرولتر من 98%beta mercaptoethanol في الأنبوب الذي يحتوي على جزء HDL. تحقق من كثافة الخليط. ضع الأنبوب في دوّار مبرد مسبقاً وقم بإجراء عملية الطرد المركزي لمدة ثلاث ساعات.

بعد ذلك، قم بإزالة 2 mL من الطبقة العلوية، والتي تمثل جزء HDL، واحفظها في درجة حرارة 4 °C. يجب إزالة الملح الزائد من أجزاء البروتينات الدهنية لتجنب التداخل مع عمليات الفصل الكهربائي لهلام الأجاروز وتفاعل PCR اللاحقة. في هذا الفيديو، سيتم توضيح عملية إزالة الأملاح والتركيز لجزء HDL فقط.

أضف 13 milliliters من محلول PBS البارد إلى جزء HDL وانقله إلى جهاز ترشيح طرد مركزي بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10K. قم بإجراء الطرد المركزي في دوّار ذي دلاء متأرجحة، بسرعة 4000 ×g، ودرجة حرارة 4 °C، لمدة 30 دقيقة. قم بإزالة الأملاح من جزء HDL مرة ثانية، باستخدام 13 milliliters من محلول PBS البارد، مع إجراء الطرد المركزي كما سبق.

بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة المذابات التي تحتوي على البروتينات الدهنية، واحفظها في درجة حرارة أربع درجات Celsius. ولتقييم جودة ونقاء البروتينات الدهنية المعزولة، تم إجراء الفصل الكهربائي بهلام الأجاروز باستخدام معايير البروتينات الدهنية البشرية، والتي أُدرجت كمرجع للحجم. وأظهرت النتائج النموذجية لعملية عزل، بدون استخدام beta mercaptoethanol، أن جزء HDL خالٍ من أي تلوث بـ VLDL ويظهر حركية alpha نموجية.

ومع ذلك، يُظهر جزء HDL أيضاً آثاراً من حركية بيتا نتيجة للتلوث بالبروتينات الدهنية. وتعمل إضافة بيتا ميركابتويثانول إلى المحلول C، خلال خطوة الطرد المركزي الأخيرة، على إزالة جميع البروتينات الدهنية الملوثة من جزء HDL بشكل فعال. ولإثبات إمكانية قياس كمية micro RNAs المحمولة في HDL البشري والمنقاة بهذه الطريقة، تم تضخيم اثنين من micro RNAs المختلفين بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (real-time quantitative PCR).

في مخططات التضخيم هذه، تمثل الخطوط الأفقية عتبة الكشف. أظهرت بيانات PCR في الوقت الحقيقي الممثلة لـ HDL المعزول، والتي تم الحصول عليها من ست عينات، كشفاً متسقاً لكل من micro RNAs. وأخيراً، تُظهر تحليلات منحنى الانصهار بوضوح قمة واحدة متميزة لكل من micro RNAs، وهو ما يتفق مع التضخيم النوعي في عملية PCR السابقة.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون تسع ساعات، بما في ذلك إجراءات إزالة الأملاح، إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم العمل في درجة حرارة تتراوح من 4 إلى 8 °C في جميع الأوقات، وضبط كثافة كل جزء من البروتينات الدهنية قبل إجراء عملية الطرد المركزي الفائق.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى، مثل المجهر الإلكتروني، للإجابة على أسئلة إضافية، مثل درجة نقاء HDL. وبعد تطوير هذه التقنية، ستسمح للباحثين في مجال المتلازمة الأيضية باستكشاف الـ micro RNAs المرتبطة بـ HDL كعلامات بيولوجية لدى البشر الذين يشتبه بإصابتهم بمرض الكبد الدهني. كما يمكن استخدامها لفهم وظيفة HDL والآليات الجزيئية التي تؤثر من خلالها على بيولوجيا الخلية بشكل أفضل.