فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في

الهدف العام من هذا الاختبار القائم على المجهر عالي الإنتاجية هو تحديد العوامل المضيفة المشاركة في عدوى Brucella لخلايا HeLa. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التفاعل بين المضيف والممرض، مثل تحديد بروتينات المضيف التي تعزز أو تمنع استعمار الممرض داخل الخلايا Brucella. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن سير العمل شبه الآلي من المختبر البيطري إلى تحليل الصور يسمح باستخدام الروبوتات وإنشاء تجارب عالية الإنتاجية والكفاءة.

وبذلك يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى حول تفاعلات مضيف Brucella باستخدام عمليات فحص siRNA. ويمكن تطبيق معظم هذا البروتوكول على استراتيجيات فحص أخرى، مثل مكتبات siRNA على سبيل المثال.

بعد استزراع خلايا HeLa وتجهيز أطباق الفحص باستخدام siRNAs وفقاً للبروتوكول النصي، يتم إذابة طبق أسود ذو 384 بئراً عن طريق الطرد المركزي عند 300 ×g وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. يتم تحضير وسط التعداء باستخدام dmem بدرجة حرارة الغرفة وبدون FCS. يتم تخفيف كاشف التعداء بنسبة 1 إلى 200 ويخلط بعناية قبل الاستخدام.

باستخدام موزع الكواشف، أضف 25 µL من وسط عفن الخلية (transfection medium) إلى كل بئر من آبار الطبق ذو الـ 384 بئراً، وامزج المحاليل عن طريق تحريك الطبق ذهاباً وإياباً. قم بحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للسماح بتكوين معقد كاشف عفن siRNA. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير خلايا HeLa عن طريق شفط وسط الزرع وإضافة 2.5 mL من 0.05%trypsin EDTA في PBS لغسل الخلايا شبه المتوافقة (subconfluent cells) في قارورة سعتها 75 cm² مرة واحدة.

بعد ذلك، أضف 1.5 milliliters من التربسين (trypsin) الطازج وانقل القارورة إلى درجة حرارة 37 °C لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تصبح الخلايا كروية. استخدم 10 milliliters من وسط dmem 60%FCS المُدفأ مسبقاً لإعادة تعليق الخلايا. ثم، استخدم عداد خلايا آلياً لحساب الخلايا قبل تحضير معلق خلوي بتركيز 10,000 خلية لكل milliliter في وسط dmem يحتوي على 16%FCS.

أضف 50 µL من معلق الخلايا إلى كل بئر من آبار كاشف عفن الخلايا (transfection reagent)، بحيث يكون هناك 500 خلية في كل بئر. حرك الطبق ذهاباً وإياباً لتوزيع الخلايا بشكل متساوٍ.

بعد ذلك، تُترك الصفيحة في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق للسماح للخلايا بالترسب. يُستخدم غشاء البارافيلم (parafilm) لإغلاق الصفيحة. ثم تُحضن في حاضنة رطبة على صفيحة ألومنيوم مُسخنة مسبقاً عند 37 درجة مئوية مع 5%C02 لمدة 72 ساعة.

يعتبر العمل مع الممرض من الفئة الثالثة B.abortus أمراً خطيراً، ويجب اتباع لوائح السلامة البيولوجية المحلية، والتي تشمل ارتداء بدلة واقية كاملة، وقفازات واقية، وقناع، ونظارات واقية. قبل يوم واحد من عملية العدوى، يتم تلقيح الكمية المحددة مسبقاً من مزرعة B.abortus البادئة في 50 milliliters من وسط TSB KM، وذلك في زجاجة ذات غطاء لولبي سعة 250 milliliter.

استخدم شريط البارافيلم لإغلاق الزجاجة، وقم بتنمية البكتيريا طوال الليل عند 37 درجة مئوية وبسرعة 100 RPM على هزاز حتى تصل الكثافة الضوئية 600.8 إلى 1.1. قم بقياس الكثافة الضوئية 600 للمزرعة البكتيرية. ثم قم بتحضير وسط العدوى عن طريق تخفيف المزرعة البكتيرية في dmem 10%FCS لتحقيق تعددية العدوى المطلوبة.

أو تعددية العدوى (MOI). باستخدام غاسلة أطباق آلية، استبدل وسط ترانسفكشن بـ 50 µL من وسط العدوى. داخل كبينة التدفق الصفحي، انقل الطبق إلى قفص جهاز الطرد المركزي وقم بمركزة طبق الـ 384 بئراً عند 400 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، استخدم غشاء البارافيلم (parafilm) لإغلاق الطبق بإحكام، ثم قم بتحضينه على لوح ألومنيوم مسخن مسبقاً عند 37 درجة مئوية و 5%C02 لمدة أربع ساعات. وبعد انتهاء التحضين، استخدم غاسلة الأطباق الآلية لغسل الخلايا باستخدام وسط dmem مع 10%FCS يحتوي على 100 micrograms per milliliter من dentrimysen أو GM وذلك لتعطيل البكتيريا خارج الخلوية. ثم، استخدم غشاء البارافيلم لإغلاق الطبق مجدداً وضعه مرة أخرى على لوح الألومنيوم المسخن مسبقاً في الحاضنة لمدة 40 ساعة أخرى لإجراء مقايسة نقطة النهاية.

لتثبيت الخلايا، استخدم أولاً PBS لغسل الآبار. بعد ذلك، استبدل PBS بـ 50 microliters من 3.7%PFA في 2 عند pH 7.4.

ثم تُحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. وبعد انتهاء فترة التحضين، يُستخدم 50 µL من PBS لاستبدال وسط التثبيت. ولصبغ العينات باستخدام غسالة الأطباق الآلية، ابدأ باستخدام 50 µL من 1% Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق لنفاذية الخلايا.

بعد غسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS، أضف 50 µL من PBS الذي يحتوي على 1 µg/mL من DAPI، ثم حضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS قبل حمايتها من الضوء. انقُل الطبق إلى المجهر الآلي.

قم بضبط معاملات المجهر. اختر العدسة الشيئية 10-X. ثم اختر تنسيق الطبق المناظر لطبق الـ 384 بئراً.

قم بالالتقاط من تسعة مواقع لكل بئر. حدد خيار تفعيل التركيز القائم على الليزر (Enable laser-based focusing). ثم قم بضبط التركيز على الطبق وقاع البئر.

بعد ذلك، قم بتعيين أول بئر تم الحصول عليه كالبئر الأولي للعثور على العينة وجميع المواقع للتركيز التلقائي للمواقع. بعد ذلك، قم بضبط إزاحة Z يدويًا للتركيز في قناة DAPI. ثم، اضغط على Find Sample لضبط التركيز على قاع البئر.

استخدم وظيفة AutoExposure للحصول على تقدير جيد لوقت التعريض. قم بتصحيح وقت التعريض يدويًا لقناة DAPI لضمان نطاق ديناميكي واسع مع تقليل التعريض الزائد. استخدم وقت التعريض هذا لتصوير عدة مواقع في جميع أنحاء الطبق.

وقم بتعديل وقت التعريض يدويًا حتى تصل أسطع البكسلات إلى حوالي 80% من السطوع الأقصى عبر المواقع. كرر الخطوات لضبط التركيز ووقت التعريض، وفقًا لذلك لجميع القنوات الأخرى. ثم ابدأ عملية الحصول على بيانات اللوحة الكاملة.

بالنسبة للمقايسة النهائية، استخدم قناتي DAPI وGFP لتصوير اللوحة بالكامل. ولإجراء تحليل صوري للخلايا المصبوغة في المقايسة النهائية، وبعد حساب نموذج التظليل، اختر مجلد الإدخال الذي يحتوي على الصور ومجلد إخراج للنتائج، وذلك وفقاً لبروتوكول النص تحت "إعدادات عرض المخرجات". بعد ذلك، حدد النص المشترك بين الصور، وقم بتحميل نماذج التظليل.

انقر فوق وضع بدء الاختبار (Start test mode) وتأكد من تعطيل إعدادات التوقف والعرض لجميع الوحدات. قم بتفعيل إعداد التوقف والعرض للوحدة التاسعة ImageMath. سيظهر رمز التوقف المُفعّل باللون الأصفر.

ستظهر وظيفة العرض المفعّلة على شكل عين مفتوحة. بعد ذلك، انقر فوق Run لتشغيل التحليل وصولاً إلى الوحدة التاسعة. في الوحدة التاسعة، قم بتعديل معامل multiply the second image by إلى قيمة تؤدي إلى كبح إشارة DAPI في Brucella دون كبح النوى.

لاختبار قيم الوحدة، اضغط على Step. انقر بزر الفأرة الأيمن على الصورة التي فُتحت مؤخراً واضبط تباين الصورة على log normalized. كرر عملية الرجوع خطوة بخطوة إلى الوحدة التاسعة.

قم بتعديل المعلمة "multiply the second image by" وتكرار تطبيق الوحدة مرة أخرى حتى يتم تثبيط إشارة Brucella تماماً، مع تقليل المناطق السوداء التي تشير إلى الإفراط في الطرح في الوقت ذاته. يتطلب إيجاد معاملات جيدة لوحدات معينة تحسيناً تدريجياً لهذه المعاملات. ومن المهم جداً تكرار تطبيق الوحدات، وتجربة قيم مختلفة ومراقبة تأثير ذلك على النتيجة المعروضة.

قم بتفعيل خاصيتي الإيقاف المؤقت والعرض للوحدة 10. حدد الأجسام الرئيسية. اضبط الحد الأدنى لمعلمة العتبة بحيث تكون مرتفعة بما يكفي لتقسيم النوى وتجاهل الخلفية.

لتحديد قيمة خطوة جيدة، قم بالتمرير فوق الوحدة، ثم انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة المدخلة واعرض المدرج التكراري حيث تشير الذروة عادةً إلى الخلفية. ابدأ من شدة الخلفية وقم بزيادة المعلمة حتى يتم تحقيق تقسيم جيد للنوى كما هو موضح في الصورة المخرجة. الهدف من مسار تحليل الصور هو تحديد الخلايا التي تحتوي على بكتيريا متكاثرة.

يتحقق ذلك من خلال تعيين عتبات مختلفة لإشارة الممرض في النواة، وحول النواة، وجسم خلية Voronoi. قم بتفعيل الإيقاف المؤقت والعرض للوحدة 15. قم بتصفية الكائنات، كما هو موضح سابقاً، ثم اضغط على Run.

اضبط القيمة الدنيا للمعيار بحيث تكون مرتفعة بما يكفي لضمان الإبقاء على الخلايا التي تظهر فيها بكتيريا Brucella بوضوح في النواة فقط، واستبعاد كافة الخلايا الأخرى عن طريق التصفية. ولتحديد القيمة المناسبة، انتقل عبر الوحدة البرمجية واعرض الصورة الناتجة، ثم قم بزيادة القيمة تدريجياً حتى يتم الإبقاء فقط على الخلايا التي تحتوي على Brucella واضحة الرؤية في النواة.

بعد تصفية الخلايا التي تحتوي على بكتيريا في المنطقة المحيطة بالنواة وجسم خلية فورونوي في الوحدتين 16 و17 وفقاً للبروتوكول المكتوب، اخرج من وضع الاختبار وألغِ تحديد جميع رموز العين الموجودة بجانب الوحدات للتأكد من عدم عرض أي من الوحدات قبل إجراء التحليل الكامل. وأخيراً، اضغط على Analyze Images لبدء التحليل. عند انتهاء التحليل، افحص صور PNG الناتجة بالإضافة إلى جدول بيانات CSV للتأكد من أن التحليل تم بشكل موثوق في جميع أنحاء الطبق.

قم بإجراء مقايسة الدخول وتقييم العدوى وفقاً للبروتوكول المكتوب. يوضح هذا الشكل مثالاً لتحليل الصور المستخدم لتحديد الخلايا المصابة تلقائياً في مقايسة نقطة النهاية. تم تحديد نوى خلايا HeLa المصبوغة بـ DAPI.

تم حساب منطقة حول النواة بعرض ثماني بكسلات تحيط بالنواة، بالإضافة إلى جسم خلية فورونوي (Voronoi) عن طريق تمديد النواة بمقدار 25 بكسل. واعتُبرت الخلية مصابة إذا تجاوزت إشارة الممرض العتبة المقابلة في مقصورة واحدة على الأقل.

تتطلب بكتيريا Brucella إعادة ترتيب خيوط الأكتين لضمان الارتباط الناجح بخلايا المضيف. وبناءً على ذلك، يُعد استنفاد ARP23 ضابطاً موجباً مناسباً لفحص siRNA. وقد أدى استنفاد ARPC3 إلى تقليل عدد الخلايا التي تحتوي على بكتيريا متكاثرة بعد يومين من العدوى.

مقارنة بالخلايا الضابطة المعالجة بـ scrambled. أظهر تحليل الصور الآلي انخفاضاً كمياً في عدوى خلايا HeLa التي تم فيها استنزاف ARPC3 مقارنة بالخلايا الضابطة في هذا الرسم البياني. كما أظهر استنزاف ARPC3 انخفاضاً في عدوى Brucella في مقايسة الدخول مقارنة بالخلايا الضابطة.

كما يتضح من انخفاض عدد بكتيريا Brucella داخل الخلايا والموضحة باللون الأصفر. وأخيرًا، أكد التحديد الكمي للعدوى عن طريق تحليل الصور الآلي أن عدد الخلايا المصابة وكذلك عدد البكتيريا داخل الخلايا المصابة قد انخفض نتيجة استنفاد ARPC3. وبمجرد إتقان هذا البروتوكول، يمكن الحصول على نتائج تحليل الصور في غضون أسبوع ونصف بعد بدء التجربة.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراجعة نتائج تحليل الصور بعناية للتأكد من أن المعلمات المختارة تعمل بشكل جيد عبر اللوحة بالكامل. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تصوير الخلايا الحية من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، كما هو الحال عند تتبع كيفية تفاعل عامل مضيف معين مع Brucella.

أو كيف يؤثر استنزاف جين معين على الديناميكيات داخل الخلوية للعدوى. بعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا العدوى لاستكشاف عوامل المضيف المطلوبة لإصابة Brucella في مقايسة خلايا HeLa. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد عوامل المضيف التي تعزز، أو تمنع، الاستعمار الناجح لخلايا HeLa بواسطة الممرض داخل الخلوي Brucella abortus.

لا تنسَ أن العمل مع بكتيريا Brucella abortus يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب اتباع لوائح السلامة البيولوجية المحلية بدقة.