فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في البروسيلا إصابة خلايا هيلا

الهدف العام من هذا الاختبار القائم على الفحص المجهري عالي الإنتاجية هو تحديد العوامل المضيفة المشاركة في عدوى البروسيلا لخلايا HeLa. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تفاعل العامل الممرض المضيف ، مثل تحديد البروتينات المضيفة التي تعزز أو تمنع الاستعمار بواسطة العامل الممرض داخل الخلايا Brucella. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن سير العمل شبه الآلي من المختبر البيطري إلى تحليل الصور يسمح للروبوتات وكفاءة عالية الإنتاجية لإنشاء التجارب.

لذلك يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لتفاعلات مضيف Brucella باستخدام شاشات siRNA. يمكن تطبيق معظم البروتوكول على استراتيجيات الفحص الأخرى. على سبيل المثال ، أو مكتبات siRNA.

بعد زراعة خلايا HeLa وإعداد لوحات الفحص باستخدام siRNAs وفقا لبروتوكول النص ، قم بإذابة صفيحة بئر سوداء 384 عن طريق الطرد المركزي عند 300 مرة G ودرجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. تحضير وسيط التعداء باستخدام dmem درجة حرارة الغرفة بدون FCS. لتخفيف كاشف الإرسال من واحد إلى 200 وخلطه بعناية قبل الاستخدام.

باستخدام موزع الكاشف ، أضف 25 ميكرولترا من وسط الإرسال إلى كل بئر من لوحة البئر 384 واخلط المحاليل عن طريق تحريك اللوحة ذهابا وإيابا. احتضان اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة للسماح بتكوين مركب كاشف تعداء siRNA. في غضون ذلك ، قم بإعداد خلايا HeLa عن طريق شفط وسط الثقافة وإضافة 2.5 مل من 0.05٪ تريبسين EDTA في PBS لغسل الخلايا الفرعية المتشاقة لقارورة مساحتها 75 سم مربع مرة واحدة.

ثم أضف 1.5 مل من التربسين الطازج وانقل القارورة إلى 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى تتجمع الخلايا. استخدم 10 مل من dmem 60٪ FCS الدافئ مسبقا لإعادة تعليق الخلايا. بعد ذلك ، استخدم عداد الخلايا الآلي لحساب الخلايا قبل تحضير تعليق خلية من 10 ، 000 خلية لكل مليلتر في dmem مع 16٪ FCS.

أضف 50 ميكرولترا من تعليق الخلية إلى كل بئر من كاشف التعداد. ينتج عنه 500 خلية لكل بئر. حرك اللوحة ذهابا وإيابا لتوزيع الخلايا بالتساوي.

ثم اترك الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق للسماح للخلايا بالاستقرار. استخدم البارافيلم لإغلاق اللوحة. واحتضانها في حاضنة رطبة على لوح ألومنيوم مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ C02 لمدة 72 ساعة.

يعد العمل مع العامل الممرض من الفئة الثالثة B.abortus أمرا خطيرا ويجب اتباع لوائح السلامة البيولوجية المحلية التي تشمل ارتداء بدلة عامة واقية وقفازات واقية وقناع ونظارات واقية. في يوم واحد ، قبل الإصابة ، قم بتطعيم الكمية المحددة مسبقا من B.abortus مزرعة بادئ في 50 مل من وسط TSB KM. في زجاجة لولبية سعة 250 مل.

استخدم البارافيلم لإغلاق الزجاجة ونمو البكتيريا بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة على شاكر إلى كثافة بصرية 600.8 إلى 1.1. قياس الكثافة البصرية 600 من الثقافة البكتيرية. وتحضير وسط العدوى عن طريق تخفيف المزرعة البكتيرية في dmem 10٪ FCS لتحقيق التعدد المطلوب للعدوى.

أو وزارة الداخلية. باستخدام غسالة اللوحة الآلية ، قم باستبدال وسط التعدي ب 50 ميكرولتر من وسط العدوى. داخل غطاء المحرك ، انقل اللوحة إلى قفص جهاز الطرد المركزي وقم بجهاز الطرد المركزي بلوحة البئر 384 عند 400 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، استخدم البارافيلم لإغلاق اللوحة واحتضانها على لوح ألومنيوم مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية و 5٪ C02 لمدة أربع ساعات. بعد الحضانة باستخدام غسالة الألواح الآلية ، استخدم dmem مع 10٪ FCS تحتوي على 100 ميكروغرام لكل مليلتر من dentrimysen أو GM لغسل الخلايا لتعطيل البكتيريا خارج الخلية. بعد ذلك ، استخدم البارافيلم لإغلاق اللوحة ووضعها مرة أخرى على لوح الألمنيوم المسخن مسبقا في الحاضنة لمدة 40 ساعة أخرى لفحص نقطة النهاية.

لإصلاح الخلايا ، استخدم أولا PBS لغسل الآبار. ثم استبدل PBS ب 50 ميكرولتر من 3.7٪ PFA. في 2 عند الرقم الهيدروجيني 7.4.

واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة ، استخدم 50 ميكرولترا من PBS لتبادل وسط التثبيت. لتلطيخ العينات باستخدام غسالة الألواح الآلية ، ابدأ باستخدام 50 ميكرولترا من 1٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق لاختراق الخلايا.

بعد استخدام PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات ، أضف 50 ميكرولترا من PBS مع ميكروغرام واحد لكل مليلتر من DAPI واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، استخدم PBS لغسل الخلايا ثلاث مرات قبل حمايتها من الضوء. انقل اللوحة إلى المجهر الآلي.

قم بإعداد معلمات المجهر. حدد 10-X ذاتي. ثم حدد تنسيق اللوحة المقابل للوحة البئر 384.

الحصول على تسعة مواقع لكل بئر. حدد تمكين التركيز البؤري المستند إلى الليزر. وركز على اللوحة والقاع جيدا.

بعد ذلك ، قم أولا بتعيين البئر الأولي للعثور على العينة وجميع المواقع للتركيز التلقائي للموقع. بعد ذلك ، بالنسبة لقناة DAPI ، اضبط إزاحة Z للتركيز يدويا. ثم اضغط على البحث عن عينة لضبط التركيز على قاع البئر.

باستخدام وظيفة التعريض الضوئي التلقائي ، احصل على تقدير جيد لوقت التعرض. قم بتصحيح وقت التعريض الضوئي يدويا لقناة DAPI لضمان نطاق ديناميكي واسع مع تعريض ضوئي منخفض. استخدم وقت التعرض هذا لتصوير عدة مواقع في جميع أنحاء اللوحة.

واضبط وقت التعرض يدويا حتى تصل وحدات البكسل الأكثر سطوعا إلى ما يقرب من 80٪ من الحد الأقصى للسطوع على المواقع. كرر الخطوات لضبط التركيز ووقت التعرض ، وفقا لجميع القنوات الأخرى. ثم ابدأ في الحصول على اللوحة الكاملة.

بالنسبة لمقايسة نقطة النهاية ، استخدم قنوات DAPI و GFP لتصوير اللوحة الكاملة. لإجراء تحليل للصور على الخلايا الملطخة في مقايسة نقطة النهاية ، بعد حساب نموذج التظليل ، وفقا لبروتوكول النص ضمن عرض إعدادات الإخراج ، حدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج مع النتائج. بعد ذلك ، حدد النص المشترك بين الصور ، وقم بتحميل نماذج التظليل.

انقر فوق بدء وضع الاختبار وتأكد من تعطيل إعداد الإيقاف المؤقت والعرض لجميع الوحدات النمطية. قم بتمكين إعداد الإيقاف المؤقت والعرض للوحدة التاسعة: ImageMath. سيظهر رمز الإيقاف المؤقت الذي تم تمكينه باللون الأصفر.

ستظهر وظيفة العرض الممكنة كعين مفتوحة. بعد ذلك ، انقر فوق تشغيل لتشغيل التحليل حتى الوحدة التاسعة. في الوحدة التاسعة، اضبط المعلمة، اضرب الصورة الثانية في قيمة من شأنها أن تمنع إشارة DAPI في Brucella دون قمع النوى.

لاختبار قيم الوحدة النمطية، اضغط على خطوة. انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة المفتوحة حديثا واضبط تباين الصورة على السجل الطبيعي. مرارا وتكرارا ، عد إلى الوحدة التاسعة.

اضبط المعلمة واضرب الصورة الثانية وخطوة فوقها مرة أخرى حتى يتم قمع إشارة Brucella بالكامل ، وفي نفس الوقت يتم تقليل المناطق السوداء التي تشير إلى الطرح الزائد. يتطلب العثور على معلمات جيدة لوحدات معينة تحسين المعلمات تدريجيا. من المهم بالتأكيد تجاوز الوحدات بشكل متكرر ، وتجربة قيم مختلفة ومراقبة التأثير على النتيجة المعروضة.

قم بتمكين الإيقاف المؤقت والعرض للوحدة 10. تحديد الكائنات الأساسية. قم بتعيين الحد الأدنى للمعلمة على العتبة ، عالية بما يكفي بحيث يتم تقسيم النوى وتجاهل الخلفية.

لتحديد قيمة جيدة ، قم بخطوة فوق الوحدة ، انقر بزر الماوس الأيمن فوق صورة الإدخال واعرض الرسم البياني حيث تشير الذروة عادة إلى الخلفية. بدءا من شدة الخلفية ، قم بزيادة المعلمة حتى يتم تحقيق التجزئة الجيدة للنوى كما هو موضح في صورة الإخراج. الهدف من خط أنابيب تحليل الصور هو تحديد الخلايا التي تحتوي على بكتيريا متكاثرة.

يتم تحقيق ذلك عن طريق تحديد عتبات مختلفة لإشارة العامل الممرض في النواة ، ومحيط النواة ، وجسم خلية فورونوي. تمكين الإيقاف المؤقت والعرض للوحدة 15. قم بتصفية الكائنات، كما هو موضح من قبل واضغط على تشغيل.

اضبط الحد الأدنى لقيمة المعلمة مرتفعا بما فيه الكفاية بحيث يتم الاحتفاظ فقط بالخلايا التي تحتوي على بروسيلا مرئية بوضوح في النواة، ويتم تصفية جميع الخلايا الأخرى. لتحديد قيمة جيدة ، خطوة فوق الوحدة وعرض صورة الإخراج. قم بزيادة القيمة تدريجيا حتى يتم الاحتفاظ فقط بالخلايا التي تحتوي على بروسيلا مرئية بوضوح في النواة.

بعد التصفية بحثا عن الخلايا التي تحتوي على بكتيريا في جسم خلية النواة المحيطة وفورونوي في الوحدتين 16 و 17 وفقا لبروتوكول النص ، اخرج من وضع الاختبار وقم بإلغاء تحديد جميع رموز العين بجوار الوحدات للتأكد من عدم عرض أي من الوحدات قبل إجراء التحليل الكامل. أخيرا ، اضغط على تحليل الصور لبدء التحليل. عند الانتهاء من التحليل ، افحص صور PNG الناتجة بالإضافة إلى جدول بيانات CSV للتأكد من أن التحليل يعمل بشكل موثوق في جميع أنحاء اللوحة.

قم بإجراء مقايسة الدخول وتسجيل العدوى وفقا لبروتوكول النص. يوضح هذا الشكل مثالا على تحليل الصور المستخدم لتحديد الخلايا المصابة تلقائيا في مقايسة نقطة النهاية. تم تحديد خلايا Nuclei HeLa الملطخة ب DAPI.

نواة محيطة بعرض ثمانية بكسل تحيط بالنواة. وتم حساب جسم خلية فورونوي بامتداد النواة ، بمقدار 25 بكسل. تم اعتبار الخلية مصابة إذا تجاوزت إشارة العامل الممرض العتبة المقابلة في حجرة واحدة على الأقل.

يتطلب Brucella إعادة ترتيب العمل من أجل المشاركة الناجحة للخلايا المضيفة. وبالتالي ، فإن استنفاد ARP23 هو عنصر تحكم إيجابي مناسب لفحص الحمض النووي الريبي. أدى استنفاد ARPC3 إلى تقليل عدد الخلايا التي تحتوي على بكتيريا متكاثرة بعد يومين من الإصابة.

مقارنة بالخلايا الخاضعة للرقابة المعالجة المخفوقة. لوحظ تحليل الصور الآلي كميا لانخفاض إصابة خلايا HeLa المستنفدة ARPC3 مقارنة بالخلايا الخاضعة للرقابة في هذا الرسم البياني. أظهر استنفاد ARPC3 أيضا انخفاضا في عدوى البروسيلا في مقايسة الدخول مقارنة بالخلايا الخاضعة للرقابة.

كما يتضح من العدد المنخفض من البروسيلا داخل الخلايا الموضحة باللون الأصفر. أخيرا ، أكد القياس الكمي للعدوى عن طريق التحليل الآلي للصور أن عدد الخلايا المصابة وكذلك عدد البكتيريا داخل الخلايا في الخلايا المصابة قد انخفض عن طريق استنفاد ARPC3. بمجرد إتقانه ، يمكن لهذا البروتوكول إعطاء نتائج تحليل الصور في غضون أسبوع ونصف بعد بدء التجربة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم مراجعة نتائج تحليل الصور بعناية للتأكد من أن المعلمات المختارة تعمل بشكل جيد في جميع أنحاء اللوحة الكاملة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تصوير خلايا الحياة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية. كما هو الحال عندما تقوم بالاتجار ، يتفاعل عامل مضيف معين مع Brucella.

أو كيف يؤثر استنفاد الجين على ديناميكيات العدوى داخل الخلايا. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا العدوى لاستكشاف العوامل المضيفة المطلوبة لعدوى البروسيلا في مقايسة خلية HeLa. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد العوامل المضيفة التي تعزز أو تمنع الاستعمار الناجح لخلايا HeLa بواسطة العامل الممرض داخل الخلايا Brucella abortus.

لا تنس أن العمل مع Brucella abortus يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب اتباع لوائح السلامة البيولوجية المحلية بدقة.