بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد خلايا جذعية أرومية غاذية مستحثة (iTSCs) حقيقية من أرومات ليفية فأرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الخلايا الجذعية فيما يتعلق بطبيعة الحاجز الذي يفصل السلالة الجنينية عن السلالة خارج الجنينية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن التعبير الجيني المحول يتم تنشيطه بشكل مؤقت فقط، مما يسهل اختيار الخلايا التي تم تحويلها بشكل مستقر.

في مختبر من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية وباستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، قم بتغطية خمسة أطباق سعة 100 مل باستخدام 5 مل من محلول Poly-L-lysine، مع هز الأطباق برفق لتوزيع محلول الطلاء بالتساوي. ضع الأطباق في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C لمدة 30 دقيقة، ثم اشفط محلول Poly-L-lysine واغسل الأطباق مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بزراعة 7 × 10⁶ من خلايا 293 T لكل طبق في 10 مل من وسط زراعة خلايا 293 T، وقم بتحريك الأطباق بشكل دائري لتوزيع الخلايا بالتساوي، ثم أعد الأطباق إلى الحاضنة.

في صباح اليوم التالي، استبدل وسط النمو بخمسة ملليلترات من وسط عفن التحول (transfection medium). بعد ذلك، عالج المزارع بستة ميكرولترات من محلول الكلوروكين (Chloroquine) بتركيز 1000X، وأعد الأطباق إلى الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C. ولتحضير خليط عفن التحول، أضف لكل ناقل فيروسي بطيء (Lentiviral vector) 600 ميكرولتر من محلول DNA الخاص بالناقل الفيروسي (Lentivector) قطرة تلو الأخرى إلى 600 ميكرولتر من محلول HEPES buffered saline بتركيز 2X مع الرج بجهاز الفورتكس (vortexing)، ثم حضّن خليط عفن التحول في درجة حرارة الغرفة.

بعد مرور 15 دقيقة، أضف المزيج بحذر شديد على شكل قطرات إلى خلايا 293 T المُحضرة، وأعد الأطباق إلى الحضانة. وبعد مرور خمس إلى ست ساعات، استبدل الوسط بـ 10 milliliters من وسط إنتاج الفيروسات، وأعد الأطباق إلى الحضانة. وفي صباح اليوم التالي، استبدل الوسط بعناية بـ سبعة milliliters من وسط إنتاج فيروسات طازج لفترة حضانة أخرى طوال الليل.

بعد ذلك، انقل الوسط من كل طبق إلى أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter منفصلة، وأضف سبعة milliliters من وسط إنتاج الفيروس الطازج إلى الأطباق لفقاسة ليلة أخرى. في صباح اليوم التالي، احصد الدفعة الثانية من الوسط المحتوي على الفيروس، وادمِج السائل الطافي مع الدفعة الأولى من الفيروس، ثم قم بترشيح الوسط المحتوي على الفيروس عبر مرشح غشائي من خلات السليلوز الخالي من المواد الخافضة للتوتر السطحي بمسامية 0.45 micron، للتخزين في حصص مقدارها 500 microliter عند درجة حرارة minus 80. ولتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا جذعية أرومية غاذية مستحثة، اغسل الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) المنقولة جينياً مرتين باستخدام اثنين milliliters من PBS.

بعد ذلك، قم بفصل الخلايا باستخدام 0.5 milliliters من محلول Trypsin EDTA عند درجة حرارة 37 °C. وبعد مرور ثلاث إلى أربع دقائق، تأكد من انفصال الخلايا عن الطبق باستخدام مجهر مقلوب، ثم قم بإبطال مفعول Trypsin بإضافة one milliliter من وسط TS. انقل معلقات الخلايا إلى أنابيب مخروطية سعة 15 milliliter منفردة، ثم قم بطرد الخلايا مركزياً.

بعد ذلك، أعد تعليق الرواسب في 2 mL من وسط TS، وازرع 2 × 10⁵ من خلايا MEFs المحولة بـ mCherry أو خلايا MEFs الضابطة غير المحولة لكل طبق سعة 100 mm في 10 mL من وسط TS الذي يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية 4 والهيبارين والمُدعم بالدوكسيسيكلين للزراعة طوال الليل. وفي اليوم التالي، تحت مجهر الفلورة فوق البؤرية، استخدم تعبير بروتين mCherry لتقدير كفاءة تحويل الخلايا. إذا كانت كفاءة التحويل حوالي 100%، أعد المزارع إلى الحاضنة، مع تغيير الوسط في جميع الأطباق كل يومين حتى اليوم 10.

بعد ذلك، يتم تغذية الخلايا بوسط TS طازج يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية الرابع وهيبارين بدون دوكسيسيكلين، مع استخدام المجهر المقلوب لمراقبة ظهور المناطق المتحولة تمايزياً في طبق العوامل الأربعة لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. يُعد تحديد المناطق المتحولة تمايزياً أمراً بالغ الأهمية، حيث إن خلايا MEFs في هذه المرحلة لا تشبه الخلايا الجذعية للأرومة الغاذية من حيث الشكل. ابحث عن مستعمرات متراكمة بكثافة بجوار الخلايا العملاقة للأرومة الغاذية، والتي يمكن التعرف عليها من خلال حجم الخلية والنواة الكبيرة.

لعزل خطوط iTSC الفردية، ابدأ بمسح المجهر المقلوب باستخدام 70%ethanol لتقليل احتمالية التلوث البكتيري. بعد ذلك، أضف 40 µL من 05%Trypsin EDTA في 12 بئرًا من لوحة بئر ذات قاع 96 U، وضع اللوحة على الثلج. الآن، قم بشفط الوسط من طبق تمايز الخلايا الليفية الجنينية (MEF) رباعي العوامل واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 mL من PBS.

بعد الغسل، أضف 10 milliliters من محلول PBS الطازج إلى الخلايا وضع الطبق على منصة المجهر المقلوب. باستخدام ماصة 100 microliter مضبوطة على 40 microliters، قم برسم دائرة حول كل مستعمرة فردية بطرف الماصة واشفط المستعمرة العائمة الناتجة. انقل كل مستعمرة إلى آبار فردية في طبق 96 well plate حتى يتم التقاط 12 مستعمرة.

ثم تُحضن المستعمرات عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. وفي نهاية فترة التحضين، يتم تفكيك الخلايا عن طريق السحب بالماصة ونقل معلقات الخلايا إلى آبار فردية في طبق يحتوي على 24 بئراً، بحيث يحتوي كل بئر على 500 µL من وسط TS الكامل المضاف إليه عامل نمو الأرومة الليفية والهيبارين من أجل الزرع لليلة واحدة. وفي اليوم التالي، يُستبدل الوسط بوسط TS كامل طازج مضاف إليه عامل نمو الأرومة الليفية والهيبارين لإزالة الخلايا الميتة، ثم يُعاد الطبق إلى المحضنة.

تتم مراقبة المزارع يومياً لظهور مستعمرات ظهارية ذات حدود ساطعة. عند ملاحظة المستعمرات، تُزرع الخلايا لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو حتى تصل درجة التلاقي إلى 70%. وفي المزارع التي يتم فيها تنشيط تعبير الجين المنقول للعوامل الأربعة، تتغير مورفولوجيا الخلايا بسرعة.

فيما بين الأيام 14 و21، تظهر مناطق متميزة من الخلايا المتحولة. تفتقر هذه المستعمرات الأولية إلى المورفولوجيا النموذجية للخلايا الجذعية الأرومية الغاذية، ومع ذلك، بمجرد استزراعها فرعيًا، تُلاحظ مورفولوجيا ظهارية مميزة ذات حواف محكمة وحدود ساطعة، تشبه إلى حد كبير الخلايا الجذعية الأرومية الغاذية الحقيقية. وعندما تظل الخلايا الجذعية الأرومية الغاذية المستحثة بالعوامل الأربعة إيجابية لعوامل النسخ الأرومية الغاذية Cdx2 وTfap2c، يمكن استخدام هذه الخطوط الخلوية في التحليلات اللاحقة سواء كانت في المختبر أو في الجسم الحي.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ستة أسابيع إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الحقن بمساعدة الانفجار (blast assisted injection) للإجابة على أسئلة إضافية حول إمكانيات التخيمر (chimerization) للخلايا الجذعية المماثلة للتروفوبلاست (iTSCs) التي تم إنتاجها. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الفصل المبكر للسلالات لاستكشاف تحويل مصير الخلايا الجنينية مقابل الخلايا خارج الجنينية في الفئران.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التحويل المباشر للأرومات الليفية الجنينية الجديدة إلى خلايا جذعية أرومية غاذية مستحثة. لا تنسَ أن العمل مع النواقل الفيروسية البطيئة (Lentiviral vectors) يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، وأنه يجب دائمًا اتباع الاحتياطات مثل إجراءات العمل المناسبة للمستوى الثاني من السلامة البيولوجية.