بروتوكول التحويل المباشر من الفئران الجنينية الخلايا الليفية إلى الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية المستحثة أو الخلايا الجذعية من الخلايا الليفية الفئرانية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الخلايا الجذعية فيما يتعلق بطبيعة الحاجز الذي يفصل بين السلالة الجنينية والجنينية الإضافية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن التعبير المعدل وراثيا يتم تنشيطه بشكل عابر فقط ، مما يسهل اختيار الخلايا المحولة بثبات.

في مختبر السلامة الحيوية من المستوى الثاني باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة ، قم بتغطية خمسة أطباق سعة 100 مليلتر بخمسة ملليلتر من محلول Poly-L-lysine ، وهز الألواح برفق لتوزيع محلول الطلاء بالتساوي. ضع الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم استنشق Poly-L-lysine واشطف الأطباق مرة واحدة باستخدام PBS. بعد ذلك ، طبق سبعة مرات من 10 إلى سادس 293 خلية تائية لكل طبق في 10 ملليلتر من وسط الخلايا التائية 293 ، قم بتدوير الأطباق لتوزيع الخلايا بالتساوي وإعادة الأطباق إلى الحاضنة.

في صباح اليوم التالي ، استبدل وسط النمو بخمسة ملليلتر من وسط التعداد. ثم عالج المزارع بستة ميكرولترات من مخزون 1000X من محلول الكلوروكين وضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية. لتحضير خليط التعدي ، لكل ناقل فيروسي ، أضف 600 ميكرولتر من محلول الحمض النووي Lentivector في 600 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن 2X HEPES أثناء الدوامة واحتضان خليط التعداء في درجة حرارة الغرفة.

بعد 15 دقيقة ، أضف الخليط بعناية فائقة إلى الخلايا التائية المحضرة 293 ، وأعد الأطباق إلى الحاضنة. بعد خمس إلى ست ساعات ، استبدل الوسط ب 10 ملليلتر من وسط إنتاج الفيروس ، ثم ضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة. في صباح اليوم التالي ، استبدل الوسط بعناية بسبعة ملليلتر من وسط إنتاج الفيروسات الطازجة لحضانة ليلية أخرى.

بعد ذلك ، انقل الوسط من كل لوحة إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 15 مليلتر وأضف سبعة ملليلتر من وسط إنتاج الفيروسات الطازجة على الألواح لحضانة أخرى بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، قم بحصاد الدفعة الثانية من الفيروس المحتوي على وسيط ، وتجميع المادة الطافية مع الدفعة الأولى من الفيروس وتصفية الفيروس المحتوي على وسط من خلال مرشح غشاء أسيتات السليلوز الخالي من الفاعل بالسطح 0.45 ميكرون للتخزين في 500 ميكرولتر Aliquots عند 80 تحت الصفر. لتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا جذعية للأرومة الغاذية المستحثة ، اغسل الخلايا الليفية الجنينية المنقولة مرتين باستخدام ملليلترين من PBS.

ثم افصل الخلايا ب 0.5 مل من محلول Trypsin EDTA عند 37 درجة مئوية. بعد ثلاث إلى أربع دقائق ، تأكد من أن الخلايا قد رفعت من اللوحة تحت مجهر مقلوب ثم قم بتنشيط التربسين بمليلتر واحد من وسط TS. انقل معلقات الخلية إلى أنابيب مخروطية فردية سعة 15 مليلتر وقم بالطرد المركزي للخلايا.

ثم أعد تعليق الكريات في ملليلترين من وسط TS ، وقم بلوحة مرتين 10 إلى العامل الخامس الرباعي mCherry أو تحكم في MEFs غير المحولة لكل طبق 100 مليلتر في 10 ملليلتر من وسط TS الذي يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية الرابع والهيبارين المكمل بالدوكسيسيكلين للاستزراع بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تحت مجهر epifluorescence ، استخدم تعبير بروتين mCherry لتقدير كفاءة التنبيغ. إذا كانت كفاءة التحويل حوالي 100٪ ، فأعد الثقافات إلى الحاضنة ، وقم بتغيير الوسيط في جميع الأطباق كل يومين حتى اليوم 10.

بعد ذلك ، قم بتغذية الخلايا بوسط TS طازج يحتوي على عامل نمو الخلايا الليفية الرابع والهيبارين بدون دوكسيسيكلين باستخدام المجهر المقلوب لمراقبة ظهور المناطق المتمايزة على طبق العوامل الأربعة لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. يعد تحديد المناطق المتمايزة أمرا بالغ الأهمية ، لأنه في هذه المرحلة ، لا تشبه MEFs الخلايا الجذعية الأرومة الغاذية من الناحية المورفولوجية. ابحث عن مستعمرات مكدسة بكثافة مجاورة للخلايا العملاقة الأرومة الغاذية والتي يتم تحديدها من خلال حجم الخلية والنواة الكبيرة.

لعزل خطوط iTSC الفردية ، امسح المجهر المقلوب أولا بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل فرصة التلوث البكتيري. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولترا من 05٪ Trypsin EDTA في 12 بئرا من صفيحة بئر سفلية 96 U ، وضع اللوحة على الجليد. الآن استنشق الوسيط من طبق التمايز MEF الخاص بأربعة عوامل واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 ملليلتر من PBS.

بعد الغسيل ، أضف 10 مل من PBS الطازج إلى الخلايا وضع اللوحة على مرحلة المجهر المقلوب. باستخدام ماصة سعة 100 ميكرولتر مضبوطة على 40 ميكرولتر ، ضع دائرة حول كل مستعمرة على حدة بطرف الماصة واستنشق المستعمرة العائمة الناتجة. انقل كل مستعمرة إلى آبار فردية من صفيحة البئر 96 حتى يتم قطف 12 مستعمرة.

ثم احتضان المستعمرات عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. في نهاية الحضانة ، قم بفصل الخلايا بسحب العينة ونقل معلقات الخلية إلى آبار فردية من صفيحة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من TS الكامل بالإضافة إلى عامل نمو الخلايا الليفية ووسط الهيبارين للاستزراع بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استبدل الوسط ب TS كامل طازج بالإضافة إلى عامل نمو الخلايا الليفية ووسط الهيبارين لإزالة الخلايا الميتة وإعادة اللوحة إلى الحاضنة.

مراقبة الثقافات يوميا لظهور مستعمرات ظهارية ذات حدود مشرقة. عندما تتم ملاحظة المستعمرات ، قم بزراعة الخلايا لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو حتى تصل إلى 70٪. في الثقافات التي يتم فيها تنشيط التعبير الجيني المعدل للعوامل الأربعة ، تغير الخلايا مورفولوجيا بسرعة.

في حوالي الأيام من 14 إلى 21 ، تظهر مناطق متمايزة متمايزة. تفتقر هذه المستعمرات الأولية إلى مورفولوجيا الخلايا الجذعية النموذجية للأرباط الغاذي ، ولكن بمجرد أن يتم زراعتها الفرعية ، لوحظ مورفولوجيا ظهارية مميزة ذات حواف ضيقة وحدود مشرقة ، تذكرنا إلى حد كبير بالخلايا الجذعية الأرومة الغاذية الحقيقية. عندما تظل الخلايا الجذعية للأرباط الغاذي المستحثة للعوامل الأربعة إيجابية لعامل نسخ الأرومة الغاذية ، Cdx2 ، و Tfap2c ، يمكن استخدام فكرة هذه الخطوط لتحليلات In vitro أو InVivo اللاحقة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ستة أسابيع إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل الحقن بمساعدة الانفجار للإجابة على أسئلة إضافية حول إمكانات الوهم في iTSCs المتولدة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في هذا المجال أو فصل النسب المبكر لاستكشاف التحويل الجنيني مقابل التحويل الجنيني لمصير الخلايا الجنينية الإضافية في الفئران.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحويل الخلايا الليفية الجنينية الجديدة مباشرة إلى خلايا جذعية مستحثة للأرومة الغاذية. لا تنس أن العمل مع نواقل العدسات يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتباع الاحتياطات مثل استخدام إجراءات العمل المناسبة من مستوى السلامة الحيوية الثانية.