التحقيق استنادا التدخل-RNA من وظيفة من حرارة صدمة بروتين 27 خلال شفاء القرنية طلائي الجرح

الهدف العام من اختبار تعداء الحمض النووي الريبي هذا هو استخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل الخاص ب HSP27 لتقييم الدور المحتمل ل HSP27 في التئام الجروح الظهارية للقرنية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بوظيفة بروتين الصدمة الحرارية 27 أثناء عملية التئام الجروح الظهارية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل هو سكروز الحمض النووي الريبي الحساس الذي تم إنشاؤه لاستهداف نسخة الحمض النووي الريبي المرسال على وجه التحديد للحث على تدهوره.

لقد تم استخدامه لتحديد العمليات الخلوية المختلفة لمساحة الآفات الجديدة. على الرغم من أن هذه التقنية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على التئام الجروح الظهارية للقرنية ، إلا أنها قد تنطبق أيضا على نظام آخر مثل الجلد والغشاء المخاطي. سيوضح الإجراء Soon-Suk Kang ، فني من مختبري.

لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة الخلايا الظهارية للقرنية البشرية في صفيحة مكونة من ستة آبار مع وسط نمو ظهارة الشعب الهوائية عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون حتى تلتقي بنسبة 95 بالمائة. بعد ذلك ، قم بتخفيف 2.5 لتر ميكرو ، أو 7.5 لتر صغير من عامل إعادة التعدي مع 100 لتر صغير من وسط المصل المخفض للتعداد. بعد ذلك ، قم بإذابة siRNA الخاص ب HSP27 و siRNA المتحكم فيه في 100 لتر ميكرو أو وسط مصل مخفض لإنشاء 10 نانومولار من siRNA الخاص ب HSP27 و 15 نانومولار من siRNA للتحكم المخفوق على التوالي.

بعد ذلك ، امزج 100 لتر صغير من محلول siRNA مع 100 لتر صغير من كاشف التعداء المخفف واحتضان الخليط لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف مجمعات الدهون siRNA إلى الخلايا. بعد حضانة لمدة أربع ساعات ، قم بتغيير الوسط إلى وسط نمو ظهارة الشعب الهوائية الكامل ، واحتضان الخلايا يومين عند 37 درجة مئوية قبل تحليل اللطخة الغربية.

في هذه الخطوة ، قم باستخراج siRNA الخاص بالتحكم في HSP27 والخلط HCECs المنقولة في خزانة السلامة البيولوجية باستخدام 100 لتر ميكرو من محلول تحلل الجليد. ثم احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة على الجليد للحث على تحلل الخلايا. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للمحللات عند 10 ، 000 مرة G لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، انقل المواد الطافية إلى أنابيب جديدة سعة 1.5 مليلتر وقم بتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، حدد تركيزات البروتين في الخلية باستخدام مقايسة بروتين برادفورد. ثم قم بتحميل العينات بكميات متساوية من بروتينات الخلية الكلية على هلام أكريلاميد بنسبة 10 بالمائة أو 12 في المائة.

قم بإخضاع الجل إلى صفحة SDS ، وانقل نطاقات البروتين المنفصلة كهربائيا إلى مرشحات النيتروسليلوز مع 200 مللي أمبير من التيار لمدة ساعة واحدة وأربع درجات مئوية. بعد ذلك ، قم بسد أغشية مرشح النيتروسليلوز بخمسة بالمائة من الحليب منزوع الدسم في TBST لمدة ساعة واحدة. ثم أضف الأجسام المضادة الأولية واحتضن الأغشية طوال الليل عند أربع درجات مئوية على شاكر.

في اليوم التالي ، اغسل الأغشية ثلاث مرات باستخدام TBST مع السماح بعشر دقائق لكل غسلة. ثم اكتشف العصابات المناعية باستخدام الأجسام المضادة للماعز المترافق بيروكسيداز الفجل في خمسة بالمائة من BSA. بعد ذلك ، احتضان الأغشية في كواشف اللومينول الغربية لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بإزالة الغشاء من محلول الكاشف. ثم قم بإزالة السوائل الزائدة بمنشفة ماصة وضعها في واقي من البلاستيك. بعد ذلك ، ضع الغشاء المغطى في شريط فيلم بحيث يكون جانب البروتين متجها لأعلى.

ضع فيلم الأشعة السينية فوق الأغشية وقم بتعريضه لمدة دقيقة واحدة. في خزانة السلامة البيولوجية ، قم بعمل جرح عن طريق سحب طرف ماصة معقمة عبر الثقافات المتقاربة لHCECs المنقولة الخاصة ب HSP27 أو المخلوطة. مباشرة بعد الجرح ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1XPBS واحتفظ بها في وسط نمو ظهارة الشعب الهوائية عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.

بعد 24 ساعة من الجرح ، التقط صورة HCECs باستخدام مجهر عمودي عند 100x وقم بإجراء تسطيح الخلفية باستخدام أمر المرشح في برنامج تحليل الصور. باستخدام الأمر تحديد القياسات ، حدد منطقة الاهتمام بنفس الشكل المضلع بالحجم الذي يمكن أن يغطي الجرح الأولي بشكل عمودي من النهاية إلى النهاية. بعد ذلك ، حدد ثلاثة مجالات اهتمام مختلفة في المنطقة المصابة لكل عينة.

قم بحساب رقم الخلية تلقائيا في كل حقل باستخدام خيار قائمة قياس حجم العد. كشف تحليل اللطخة الغربية الموضح هنا أن التعبير عن HSP27 الفسفوري و Akt الفسفوري قد انخفض بشكل كبير. حيث تم زيادة التعبير عن الظهر بشكل كبير في HSP27 ، تم نقل siRNA الخاص ب HCECs.

تم تقليل تعبير HSP27 الفسفوري بنسبة 30 في المائة و 40 في المائة في 10 نانومولار و 15 نانومولار من خلايا siRNA المنقولة الخاصة ب HSP27 على التوالي ، مقارنة بخلايا التحكم siRNA المنقولة. علاوة على ذلك ، تم تقليل تعبير HSP27 غير الفسفوري بنسبة 20 في المائة و 30 في المائة في عشرة نانومولار و 15 نانومولار من خلايا siRNA الخاصة ب HSP27 على التوالي. أشارت مقايسة الجرح الاتجاهي الناجم عن الخدش إلى أنه بعد 24 ساعة من الجرح ، قام siRNA الخاص ب HSP27 بنقل الخلايا عند 10 و 15 نانومولار مما أدى إلى تقليل الهجرة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن siRNA الخاص ب HSP27 ، وقد خضع HCEC لموت الخلايا المبرمج والنخرس مقارنة بالخلايا المنقولة siRNA للتحكم المخفوق ، كما هو موضح بواسطة قياس التدفق الخلوي. بمجرد إتقان تقنية تعداء الحمض النووي الريبي ، يمكن إجراؤها في غضون 24 ساعة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذه الإجراءات ، يمكن إنشاء حلقة مثل قفل الفم من أجل الإجابة على سؤال إضافي مثل الوظيفة الأولية لبروتين الصدمة الحرارية 27 في التئام الجروح الظهارية للقرنية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام حمض الريبي الصغير المتداخل لبروتين الصدمة الحرارية 27 لتقييم الدور المحتمل لبروتين الصدمة الحرارية 27 في التئام الجروح الظهارية للقرنية. لا تنس أن العمل مع الحمض النووي الريبي والكواشف الصغيرة المتداخلة يمكن أن يكون خطيرا ويجب دائما استخدام السلائف مثل خزانة السلامة البيولوجية والقناع الواقي أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.