إعداد النوى الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين لكلا RNA واستخراج الحمض النووي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي بالتتابع من نوى الأنسجة المضمنة في البارافين الثابتة بالفورمالين. هذا بروتوكول لحصاد نوى الأنسجة الذي سنستخرج منه كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هي أنه يحسن إنتاجية الحمض النووي الريبي والحمض النووي من المناطق المستهدفة بدقة في كتلة الأنسجة.

تم تطوير هذا الإجراء إلى حد كبير في أنسجة سرطان البروستاتا الأرشيفية. يمكن أيضا تطبيقه على أنواع أخرى من الأنسجة الأرشيفية. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن خطوات حفر الأنسجة لا تستخدم بشكل شائع في مختبرات الأبحاث.

معظم مختبرات الأبحاث المقاطع العرضية بدلا من ذلك ، مما يؤدي إلى استنفاد الأنسجة بشكل أسرع ويضيف عدم تجانس كبير إلى العينة. ابدأ بمراجعة شريحة المجهر وتحديد المنطقة ذات الاهتمام باستخدام علامة دائمة دقيقة النقطة. بعد ذلك ، قم بقص جزء من فيلم البارافين كبيرا بما يكفي لتغطية منطقة الاهتمام على شريحة المجهر.

بعد ذلك ، ضع الفيلم بإحكام على الشريحة ، ولف الفيلم على الحواف لمنعه من الانزلاق. باستخدام علامة دائمة دقيقة ، حدد الخطوط العريضة للأنسجة بأكملها ومنطقة الاهتمام داخل الأنسجة. بعد ذلك ، قم بإزالة الفيلم من الشريحة ونقله إلى كتلة الأنسجة المقابلة.

قم بتوجيه الفيلم عن طريق قلبه أو تدويره بحيث يتطابق الخطوط العريضة للأنسجة بأكملها مع الشكل المرصود للأنسجة في الكتلة. اضغط على قسم الفيلم بقوة على سطح الكتلة لمنع الانزلاق. باستخدام طرف العلامة الدائمة ، قم بعمل مسافات بادئة ضحلة ولكن مرئية على طول الخطوط العريضة لمنطقة الاهتمام ثم قم بإزالة الفيلم.

بعد ذلك ، قم بتنظيف لكمة المستقبل من مجموعة الثقب 0.6 ملم عن طريق غمر الطرف في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر يحتوي على مليلتر واحد من المبيض وتحريك الثقب لأعلى ولأسفل عدة مرات. كرر الغسيل بالأنبوب الذي يحتوي على 70 في المائة من الإيثانول ، ثم الماء. الآن اضغط على الثقب الذي تم تنظيفه في المنطقة محل الاهتمام على عمق ثلاثة ملليمترات واسحبه.

حرر اللب في أنبوب طرد مركزي صغير منخفض الارتباط عن طريق دفعه للخارج من الثقب باستخدام القلم. أضف ملليلترا واحدا من الزيلين إلى أنابيب الطرد الدقيق التي تحتوي على نوى الأنسجة والدوامة بقوة لمدة عشر ثوان. ثم ضعها في كتلة حرارية مضبوطة على 50 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.

بعد الحضانة ، جهاز الطرد المركزي لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة بأقصى سرعة. بعد الطرد المركزي ، ضع النوى على الجليد لمدة خمس دقائق لتصلب البقايا الشمعية. الآن ، قم بإزالة البارافين الذي تراكم حول الغضروف المفصلي بعناية مع المادة الطافية باستخدام طرف الماصة.

ثم كرر علاج الزيلين. بعد إزالة مزيج البارافين زيلين ، أضف ملليلتر واحد من الإيثانول بنسبة 100 في المائة والدوامة بقوة لمدة عشر ثوان. بعد الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقتين ، تخلص من الإيثانول بعناية.

كرر غسل الإيثانول مرة أخرى قبل البدء في التجانس. أعد تعليق النوى منزوعة البرافين في 700 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100 في المائة قبل التجانس. استخدم مجانس الأنسجة الآلي على إعداد متوسط لطحن النوى إلى جزيئات دقيقة.

مطلوب تجانس شامل لنوى الأنسجة لتحقيق الإنتاجية المثلى للحمض النووي والحمض النووي الريبي. بعد ذلك ، املأ أنابيب منفصلة سعة 15 ملليلترا بحوالي عشرة ملليلتر من المبيض ، ومحلول تحييد RNase ، و 70 بالمائة من الإيثانول. بعد تجانس العينة ، اغسل مسبار الخالط في كل من محاليل التنظيف بالترتيب.

قم بتشغيل الخالط بأعلى سرعة أثناء مرحلة الغسيل. امسح المسبار بمنديل واترك المسبار يجف تماما قبل تجانس العينة التالية. افحص شفرات المسبار بصريا بحثا عن قطع الأنسجة المتبقية ، وإذا وجدت ، فقم بتنظيف المسبار مرة أخرى.

بعد التجانس ، ارفع حجم العينة إلى مليلتر واحد مع 100 في المائة من الإيثانول ، ثم جهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 15 دقيقة. شفط الإيثانول بعناية وجفف الكريات بالهواء لمدة 15 إلى 20 دقيقة قبل البدء في استخراج البروتيناز K. أعد تعليق الكريات في 150 ميكرولتر من محلول الهضم البروتيناز K ونفض الغبار عن الأنابيب لفك الحبيبات.

يوصى بهضم البروتيناز K بين عشية وضحاها لاستعادة الحمض النووي بشكل أكبر. أضف 10 ميكرولترات من البروتيناز K المستقر في درجة الحرارة واخلطها عن طريق النقر. احتضن عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع تحريك خفيف.

احتضان الأنابيب على الجليد لمدة ثلاث دقائق. بعد التبريد ، قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 دقيقة بأقصى سرعة. بعد ذلك ، دون إزعاج الكريات ، انقل كل مادة طافية بعناية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد لتنقية الحمض النووي الريبي.

استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي باستخدام الإجراء الأمثل في البروتوكول المكتوب ، والذي يتضمن وقتا طويلا لهضم الأنسجة لاستخراج الحمض النووي. يمكن استرداد الحمض النووي الريبي والحمض النووي من عينات الأنسجة القديمة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين باستخدام هذه الطريقة. تم استخراج الأحماض النووية من عينات سرطان البروستاتا التي تتراوح من ثلاث إلى 14 عاما في عمر العينة.

كان متوسط العائد 2،270 نانوغراما من الحمض النووي الريبي و 820 نانوغراما من الحمض النووي. ومن المثير للاهتمام أنه لم يكن هناك ارتباط كبير بين عمر عينة الأنسجة واستعادة الحمض النووي. بشكل عام ، كانت غلة الحمض النووي الريبي والحمض النووي مرتبطة عبر العينات ، على الرغم من أنه في معظم الحالات ، تم استرداد أكثر من ضعف كمية الحمض النووي الريبي بالنسبة للحمض النووي.

لإثبات أداء الحمض النووي الجيني المستخرج باستخدام هذا البروتوكول ، تم تضخيم مستخلصات الحمض النووي المحولة من ثنائي الكبريتيت من عينات سرطان البروستاتا الأرشيفية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة. تم استخدام العناصر المتكررة ALU كعنصر تحكم في المثيلة وأظهرت تباينا طفيفا بين العينات. GSTP1 ، وهو جين معروف بأنه مفرط الميثيل في سرطان البروستاتا ، لم يظهر أي تضخيم يمكن اكتشافه عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة عند استخدام الحمض النووي المستخرج من عينات حميدة.

أظهرت عينات الحمض النووي من المرضى المصابين بسرطان البروستاتا العدواني قيم عتبة دورة QPCR التي يمكن اكتشافها والتي كانت أقل من تلك الموجودة في خلايا سرطان البروستاتا البطيئة ، مما يشير إلى زيادة مثيلة GSTP1 في سرطان البروستاتا العدواني. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاث إلى أربع ساعات للحمض النووي الريبي ، وبعد الهضم طوال الليل ، في أربع ساعات للحمض النووي إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. يجب أن تمكن هذه التقنية الباحثين في علم الأمراض الجزيئي من استكشاف المؤشرات الحيوية للحمض النووي والحمض النووي الريبي التشخيصي في مجموعة متنوعة من السرطانات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير نوى الأنسجة لاستخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي من مناطق الاهتمام المعينة بدقة في كتل الأنسجة الأرشيفية.