مقارنة التبغ طرق إزالة المضيف بروتين الخلية من قبل السلق النباتات سليمة أو عن طريق المعالجة الحرارية من مقتطفات

الهدف العام من هذه المجموعة من التجارب هو ترسيب بروتينات الخلايا المضيفة النباتية باستخدام الحرارة، مما يسهل عملية التنقية الكروماتوغرافية اللاحقة للبروتينات الصيدلانية الحيوية المؤتلفة. يمكن لهذه الطريقة أن تساهم في تبسيط تطوير العمليات وزيادة استقرار المنتج، على سبيل المثال عن طريق تثبيط البروتيازات الخاصة بالمضيف.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في سهولة تنفيذها ضمن البروتيازات الموجودة، وإمكانية تكييفها بسرعة مع مختلف البروتينات المستهدفة. ستقوم هانا جروتشو، طالبة الماجستير في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء. وذلك لترسيب بروتينات الخلية المضيفة عن طريق التسخين.

على سبيل المثال من أوراق التبغ. بعد استزراع نباتات التبغ وفقاً للبروتوكول النصي، قم بإعداد حمام مائي بحجم تشغيلي قدره ثمانية لترات في دلو من رغوة البوليسترين العازلة للحرارة. انقل المجموعة كاملة إلى لوح تحريك مغناطيسي، وضع قضيباً مغناطيسياً في الحمام المائي.

ثم أحط قضيب التحريك ببلاطة دعم غير مغناطيسية ترتفع عن قضيب التحريك بنحو سنتيمتر واحد. وسيتم وضع سلة من البولي بروبيلين فوقها لاحقاً خلال الإجراء. أضف ثمانية لترات من المحلول المنظم إلى الحمام المائي.

ثم ضع سلة من البولي بروبيلين مقاس 23 × 23 × 23 سنتيمتر على بلاط الدعم. تأكد من أن الدعامة لا تعيق دوران قضيب التحريك، وأن السلة مغمورة بالكامل في السائل. ثم قم بإزالة السلة.

استخدم منظم حرارة قابل للتعديل لضبط درجة حرارة الحمام المائي على 70 درجة Celsius. انتظر لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة لضمان وصول الجهاز بالكامل إلى حالة التوازن الحراري. بعد ذلك، قم بتجهيز عينات مقدار كل منها 150 gram من أوراق التبغ.

ضع حصة واحدة في السلة مع تجنب الضغط غير القابل للاسترجاع أو إتلاف الأوراق، عن طريق التمزق على سبيل المثال. اغمر السلة بعناية وبسرعة في السائل الساخن وضعها على بلاطات الدعم.

بعد ذلك، ضع كتلة من الفولاذ المقاوم للصدأ فوق السلة لمنع الطفو. قم بتحضين الأوراق لمدة خمس دقائق في سائل السلق، أو اختر الوقت المناسب لتصميم التجربة.

راقب درجة حرارة السائل طوال فترة التحضين. بعد انتهاء التحضين، أخرج السلة بعناية من سائل السلق واترك الأوراق تتصفى لمدة 30 ثانية. ثم أخرج أوراق النبات من السلة، وانقلها إلى الخلاط، وابدأ عملية الاستخلاص فوراً وفقاً للبروتوكولات النصية.

لتسخين جسيمات HCPs المترسبة في وعاء مجهز بمقلب. انقل حماماً مائياً إلى لوح تقليب مغناطيسي وضع وعاءً من الفولاذ المقاوم للصدأ سعة لترين داخل الحمام المائي بحيث يكون مركز الوعاء محاذياً لمركز لوح التقليب. ضع قضيب تقليب مغناطيسي في وعاء الفولاذ المقاوم للصدأ.

املأ الوعاء بمحلول الاستخلاص المنظم. ثم بالماء منزوع الأيونات. املأ الحمام المائي حتى مستوى خمسة سنتيمترات تحت الحافة العلوية للوعاء المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ.

استخدم غطاءً من رغوة البوليسترين لتغطيته. بعد ذلك، أدخل مقياس حرارة في الوعاء المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ من خلال فتحة مخصصة في الغطاء. ثم اضبط درجة حرارة الحمام المائي على 78 °C وحضّن المجموعة كاملة لمدة 15 دقيقة للوصول إلى حالة التوازن الحراري.

عندما تصل المجموعة إلى حالة الاتزان، أفرغ الوعاء واسكب 300 milliliters من المستخلص في الوعاء بينما لا يزال في الحمام المائي وابدأ تشغيل المؤقت. قم بتقليب المستخلص بسرعة 150 rpm أثناء التحضين لمدة خمس دقائق. تأكد من وصول المستخلص إلى درجة حرارة 70 degrees Celsius لمدة دقيقتين على الأقل خلال فترة التحضين.

بعد انتهاء فترة التحضين، قم بإزالة حمام الماء الساخن من فوق المحرك المغناطيسي. أخرج الوعاء المصنوع من الفولاذ المقاوم للصدأ وضعه في دلو يحتوي على ماء مثلج. ثم ضع الدلو فوق لوح التحريك.

تأكد من تقليب متجانس النبات جيداً بسرعة 150 rpm. ضع مقياس الحرارة في المستخلص واحضه حتى تصل درجة حرارته إلى 20 °C أو درجة الحرارة المحددة. بعد تجهيز حمامين مائيين بحجم تشغيلي قدره ثمانية لترات وفقاً لبروتوكول النص، استخدم الماء منزوع الأيونات لملء الحمام الأول.

اضبط منظم الحرارة على 74.5 °C واحضن التجميعة لمدة 15 دقيقة للوصول إلى التوازن الحراري. قم بتجهيز وعاء تخزين معزول عن طريق وضع بيكر بلاستيكي سعة 0.5 لتر داخل بيكر بلاستيكي سعة لتر واحد، واستخدم مادة عازلة مثل القطن لملء الفراغات.

باستخدام أنابيب LS24، قم بتوصيل المبادِل الحراري بمضخة تمعجية من أحد الطرفين، وبخرطوم مخرج من الطرف الآخر. ضع كلا طرفي الأنابيب مع ميزان الحرارة في وعاء تخزين معزول. ثم املأه بـ 300 milliliters من منظم الاستخلاص.

بعد ذلك، ضع المبادل الحراري في حمام الماء الساخن، وشغّل المضخة 연동ية بمعدل 300 milliliters per minute. بعد ثلاث دقائق، تأكد من أن درجة الحرارة الناتجة في الوعاء هي 70 °C، وهي أقل بنحو 4.5 °C من درجة الحرارة المحددة لحمام الماء.

تخلص من محلول الاستخلاص الموجود في الوعاء المعزول، وقم بتجهيز حصص حجم كل منها 300 milliliter من مستخلص النبات. ثم املأ الوعاء المعزول باستخدام حصة واحدة. الآن، قم بضخ مستخلص النبات عبر المبادل الحراري بمعدل 300 milliliters في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

ثم تأكد من أن درجة حرارة المستخلص قد وصلت إلى 70 درجة Celsius بعد مرور ثلاث دقائق، أو اجعل درجة الحرارة مساوية للقيمة المحددة في التصميم التجريبي. وبعد خمس دقائق، انقل المبادل الحراري إلى حمام مائي مبرد بالثلج. وتأكد من أن درجة حرارة المستخلص أقل من 30 درجة Celsius قبل المتابعة.

قم بإزالة خرطوم الإدخال المتصل بالمضخة 연동ية من الوعاء المعزول. واستمر في الضخ لجمع مستخلص النبات المترسب حرارياً من داخل المبادل الحراري. ثم أوقف تشغيل المضخة.

لإجراء عملية الترشيح الكيسي للمستخلص النباتي، قم بتركيب مرشح كيسي في سلة الدعم المقابلة المثبتة في مبيت المرشح. ضع وعاءً سعة لتر واحد أسفل السلة، ثم أضف حصص المستخلص إلى الكيس بمعدل 150 milliliters في الدقيقة. وبعد الترشيح، استخدم مقياس العكرة لقياس عكرة تخفيف بنسبة 1 إلى 10 من الرشاحة في محلول الاستخلاص المنظم.

قم بتجزئة عينة بحجم 1 mL ومعالجة الرشاحة المستخلصة من الكيس؛ على سبيل المثال، من خلال الترشيح العميق والكروماتوغرافيا. ثم قم بتحليل العينة وفقاً للبروتوكول المذكور في النص.

يقلل الترسيب الحراري لبروتينات الخلية المضيفة عن طريق السلق من إجمالي البروتين القابل للذوبان أو TSP بنسبة 96 ± 1%. وقد استعاد السلق ما يصل إلى 83 ± 1% من DsRed و51% من البروتين المستهدف Vax8، مما أدى إلى زيادة نقاوته من 0.1% إلى 1.2% قبل الفصل الكروماتوغرافي.

انخفضت سعة المرشح عند درجات حرارة السلق التي تزيد عن 63 °C. ويمكن معالجة ذلك عن طريق إضافة المندفات بعد استخلاص البروتين ومساعدات الترشيح بعد الترشيح الكيسي. وقد أزالت وعاء تحريك للترسيب الحراري بحد أقصى 84 ± 1% من بروتينات الخلية المضيفة (HCPs).

تحقيق نقاوة تبلغ 0.33 ± 0.02% لـ Vax8 و 20.2 ± 1.4% لـ DsRed. وبخلاف عملية السلق وإعداد المبادل الحراري، فإن ترسيب HCP في وعاء يزيد من سعة الترشيح العميق في المراحل اللاحقة بمقدار 2.5 ضعفاً. ويعكس ذلك انخفاض قوى القص في الوعاء مقارنةً بضخ المستخلص عبر المبادل الحراري أو التجانس بعد السلق.

تمت إزالة ما يقرب من 88.3 ± 0.7 بالمائة من محتوى البروتينات المضيفة (HCP) باستمرار من المستخلص باستخدام مبادل حراري بين 60 و70 درجة مئوية. مع تحقيق درجة نقاء بلغت 0.31 ± 0.01 بالمائة لـ Vax8، و27.6 ± 2.0 بالمائة لـ DsRed.

وأخيرًا، حقق المبادل الحراري أيضًا أدنى سعة لفلتر العمق في المصب، حيث تم توضيح 13.5 ± 6.0 لتر لكل متر مربع فقط قبل حدوث الانسداد. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في أقل من 50 دقيقة بالإضافة إلى وقت العينة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة تطبيق هذه الطريقة، من المهم تذكر التأكد من أن البروتين المستهدف مستقر حرارياً. وعقب اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكروماتوغرافيا من أجل تنقية المنتج بشكل أكبر للوصول إلى المستوى المطلوب. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تكنولوجيا النبات لاستكشاف تنقية البروتينات المرشحة للقاحات وأنواع nicotiana.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية ترسيب بروتينات الخلايا المضيفة النباتية باستخدام السلق، أو الوعاء المقلب، أو المبادل الحراري.