تحديد قمع نظام المناعة مقابل حماية الجهاز العصبي المركزي للالدوائية التدخلات في إزالة الميالين المناعة الذاتية

الهدف العام لهذه الطريقة المفاهيمية هو تحديد ما إذا كانت العلاجات الدوائية لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي تظهر حماية الجهاز العصبي المركزي أثناء هجمة تسلل الخلايا المناعية أو نتيجة لقمع تسلل الخلايا المناعية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال المناعي العصبي. مثل ، كيف يميز التلاعب بأوقات علاج EAE بين التأثيرات على تسلل الخلايا المناعية مقابل الحماية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية أيضا إلى علاج التصلب المتعدد ، حيث لا توجد حاليا علاجات وقائية عصبية لهذا المرض. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما اكتشفنا أن علاج الفئران EAE بمثبط لناقل Xc للنظام كان وقائيا للأعصاب ومناعا. على الرغم من أنه يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة العلاجات الدوائية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الدراسات التي تستخدم الفئران بالضربة القاضية الجينية المعرضة ل EAE أو غيرها من التلاعبات.

ابدأ باستخدام مقص معقم لفرم الأدمغة والحبال الشوكية من الفردية إلى قطع صغيرة. ثم استخدم مكبس حقنة واحد سعة ثلاثة مليلتر لكل نسيج لهرس كل عينة على مصافي خلايا فردية 70 ميكرون في أنابيب مخروطية فردية سعة 50 مليلتر أثناء شطف المصافي بوسط. عندما يتم نقع جميع القطع ، قم بإحضار الحجم النهائي في الأنابيب حتى 50 مل مع وسط جديد ، ثم قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية.

أعد تعليق كل حبيبات في أربعة ملليلتر من 40٪ محلول تدرج الكثافة. ثم ضع طبقة من الخلية ببطء أسفل جدران الأنابيب المخروطية الفردية سعة 15 مليلتر فوق ملليلترين من محلول التدرج الكثافة 70٪ لكل أنبوب. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي واستخدم ماصات نقل سعة مليلتر واحد للتخلص بعناية من طبقات المايلين العليا.

بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا القابلة للحياة من واجهات العينة إلى أنابيب مخروطية جديدة سعة 15 مليلتر وغسل الخلايا في حجم نهائي يبلغ 15 مل من الوسط الطازج لكل أنبوب. أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من الوسط الطازج وانقل معلقات الخلية إلى آبار فردية من 96 صفيحة سفلية مستديرة بئر. قم بالطرد المركزي على اللوحة ونفض الغبار عن المواد الطافية.

بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في 200 ميكرولتر من وسط إعادة التحفيز واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. في نهاية الحضانة ، قم بالطرد المركزي للوحة مرة أخرى وإزالة المواد الطافية. ثم اغسل الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS مكملة بنسبة 2٪ FCS وأعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من PBS مع 2٪ FCS و FC-block لمدة 10 إلى 15 دقيقة على الجليد.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا كما هو موضح للتو وأعد تعليق الكريات في 15 ميكرولترا من كوكتيل بقع سطح الخلية لمدة 15 دقيقة على الجليد. ثم قم بتدوير الخلايا وغسل العينات مرتين في 200 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق الخلايا في كواشف تلطيخ عامل النسخ FOXP3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمدة 30 دقيقة إلى الليل عند 4 درجات مئوية.

في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا وإعادة تعليق الكريات في الأجسام المضادة داخل الخلايا ذات الأهمية في 15 ميكرولترا من المخزن المؤقت للنفاذية على الجليد. بعد 30 دقيقة ، قم بتدوير الخلايا متبوعة بثلاث غسلات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية.

بعد الغسيل الأخير ، قم بتعليق الكريات في 200 ميكرولتر من PBS وقم بتحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي ، والبوابات على الخلايا الحية الإيجابية ل CD4 ، والخلايا الإيجابية ل TCR. من المهم أيضا تقييم تكاثر الخلايا التائية المحيطية لأن التغيرات في المحيط يمكن أن تؤثر على تسلل الخلايا المناعية إلى الجهاز العصبي المركزي. لتحديد عدد الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الموجودة في عينات أنسجة الحبل الشوكي بعد تحريض EAE ، احصل على صور لكل قسم بتكبير 4x واحفظ الصور كملفات TIFF.

بعد ذلك ، في ImageJ ، حدد الصورة محل الاهتمام واستخدم أداة تحديد المضلع لتتبع قسم الأنسجة الشوكية بالكامل. ضمن قائمة الصورة ، حدد النوع و 16 بت لتحويل الصورة إلى 16 بت. بعد ذلك ، افتح قائمة العملية وحدد خلفية الموضوع لضبط نصف قطر الكرة المتدحرجة على الأقل حجم أكبر كائن ليس جزءا من الخلفية.

تحقق من القطع المكافئ المنزلق وانقر فوق موافق. ثم ، ضمن الصورة ، حدد ضبط والحد ، واستخدم الأشرطة المنزلقة لتعيين مستوى الحد الأدنى. للحصول على النسبة المئوية للمنطقة العتبة داخل المنطقة المحددة، ضمن تحليل القياسات وتعيينها، حدد كسر المنطقة. تأكد من عدم تحديد الحد إلى الحد وتحديد تسمية العرض، وانقر فوق OK.To الحصول على القياسات، ضمن التحليل، حدد القياس.

سيظهر مربع منبثق للنتائج. احفظ هذه البيانات وقارن قيم كسر المنطقة بين مجموعات العلاج. لتحديد كمية تلطيخ المايلين الأساسي بالكثافة البصرية ، افتح الصورة محل الاهتمام واستخدم أداة أقسام المضلع لرسم منطقة اهتمام داخل العينة.

ضمن تحليل القياسات وتعيينها، حدد متوسط القيمة الرمادية وتأكد من عدم تحديد الحد إلى الحد، وتم تحديد تسمية العرض. انقر فوق موافق. ثم ، ضمن قائمة التحليل ، حدد قياس. سيظهر مربع منبثق جديد للنتائج مع بيانات متوسط القيمة الرمادية لبروتين المايلين الأساسي.

يسمح تحليل إزالة الحبل الشوكي وقياس التدفق الخلوي بتقييم تسلل الخلايا المناعية للجهاز العصبي المركزي ، حيث يكون تسلل الخلايا المناعية في ذروة المرض هو الحد الأقصى يمكن أن يكشف التحليل الإحصائي لأعداد الخلايا الإيجابية CD4 ، وإيجابية جاما ، وإيجابية الإنترفيرون ، وإيجابية IL-17 ، وإيجابية FOXP3 عن أهمية التغييرات التي لوحظت في أعداد الخلايا التائية الإيجابية ل CD4 في المعالجة بالمخدرات ، مقابل الضابطة ، مع تحليل التعبير المشترك المتعمق الضروري لاستبعاد الانحراف كعامل مربك في الانخفاض الكلي لعدد الخلايا التائية الإيجابية ل CD4. للقضاء على احتمال أن يكون انخفاض تسلل الجهاز العصبي المركزي إلى الخلايا التائية نتيجة لتثبيط التكاثر والتنشيط والتمايز في المحيط ، يمكن تقييم عدد الخلايا التائية التي تتكاثر بنشاط ونسبة الأنواع الفرعية للخلايا التائية.

للتقييم الكمي لسلامة المايلين ، يمكن إجراء تحليل إحصائي للكثافة البصرية لتلوين بروتين المايلين الأساسي ، مما يكشف عن إزالة الميالين بشكل كبير من أنسجة الحبل الشوكي في الضربة القاضية الجينية غير المحددة مقارنة بزملائها من النوع البري ، على سبيل المثال. لإثبات أن الالتهاب العصبي مستمر أو ينخفض عن طريق التدخلات العلاجية ، يمكن أيضا تقييم الدبقي التفاعلي عن طريق قياس متوسط مساحة الكسر للداء الدبقي التفاعلي كما هو موضح للتو. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال تقنية قياس التدفق الخلوي في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح ، بينما يمكن إجراء القياس الكمي لتلوين الأنسجة في حوالي ساعتين لكل بقعة.

يمكن تقييم التعديل المناعي عن طريق إدخال العلاجات قبل تسلل الخلايا المناعية لتحديد التغيرات المهاجرة والتكاثرية في الخلايا التائية. يمكن تقييم حماية الجهاز العصبي المركزي عن طريق إدخال العلاجات خلال ذروة المرض عندما تكون الخلايا المناعية قد تسللت بالفعل إلى الجهاز العصبي المركزي. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقييم إعدادات العتبة المثلى في ImageJ للتمييز المحدد للتلوين الخلوي فقط.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم آثار علاجات معينة على الجهاز العصبي المركزي ، وتكاثر الخلايا التائية ، واستجابات الهجرة. عن طريق تغيير أوقات العلاج قبل وبعد تسلل الخلايا المناعية.