إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

الهدف العام من بروتوكول الحث الدموي هذا هو تحفيز عملية نمائية في الخلايا الليفية للفئران من خلال الإفراط في تعبير عوامل النسخ لتوليد خلايا سلف دمويّة في المختبر تنتج خلايا مكونة للدم عند استزراعها لفترات طويلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال البرمجة المكونة للدم، مثل إمكانية تطوير بروتوكول للحصول على خلايا جذعية مكونة للدم (HSCs) حقيقية من نقطة الصفر تكون قادرة على التمايز إلى سلالات متعددة والقدرة على التطعيم. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه من خلال الإفراط في تعبير مجموعة محدودة من عوامل النسخ، يمكن بدء العملية النمائية في الخلايا المعاد برمجهتا دون الحاجة إلى المرور بمرحلة وسيطة متعددة القدرات.

بعد استزراع الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEFs)، وإنتاج الفيروس وفقاً للبروتوكول المكتوب، استخدم جيلاتين بتركيز 0.1% في محلول PBS لطلاء أطباق ذات 6 آبار مسبقاً، مع التأكد من تغطية الجيلاتين لكامل مساحة البئر. ضع الأطباق في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.

بعد ذلك، قم بإزالة الأطباق وسحب الجيلاتين. ازرع الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEFs) في وسط DMEM القياسي بكثافة 25, 000 خلية لكل بئر، واترك الخلايا لتستقر عند 37 °C طوال الليل. قم بتحضير كوكتيل فيروسي بحجم 100 µL عن طريق خلط 50 µL من M2RTTA و 12.5 µL لكل من GATA2 و GFI1B و CFOS و ETV6.

قم بشفط الوسط من خلايا MEFS وأضف 2 mL من وسط DMEM القياسي مع 8 µg/mL من هكساديميثيرين بروميد. بعد ذلك، قم بنقل الفيروس إلى كل بئر من خلايا MEFs باستخدام 15 µL من خليط الفيروسات، ثم حضنها عند 37 °C طوال الليل. وبعد فترة حضانة تتراوح من 16 إلى 20 ساعة، استبدل الوسط في كل بئر بـ 2 mL من وسط DMEM القياسي الطازج، المضاف إليه 1 µg/mL من DOX.

يتم التحضين عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. وفي اليوم الرابع، يتم تحضير وسط استنبات الخلايا المكونة للدم المكمل بـ hydrocortisone، وعامل الخلايا الجذعية (stem cell factor)، وربيطة كيناز التيروزين الثالث المرتبط بـ MFS، وإنترلوكين 3، وإنترلوكين 6، وDOX. بعد ذلك، يتم سحب الوسط من الخلايا الليفية الجنينية للفأر (MEFs) واستخدام 1 mL من PBS لغسل الخلايا.

بعد ذلك، وبعد سحب محلول PBS، أضف 1 ml من التريبسين بتركيز 0.05% لكل بئر لفصل وجمع الخلايا. وباستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer)، قم بعدّ الخلايا، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 300 ×g لمدة خمس دقائق، واستخدم 12 ml من الوسط المكون للمكونات المكونة للدم (hematopoietic medium) الذي تم تحضيره للتو لإعادة تعليق الخلايا. بعد ذلك، قم بزراعة 10,000 خلية لكل بئر في أطباق ذات ستة آبار مطلية بالجيلاتين.

كل ستة أيام، استبدل الوسط بوسط زراعة للخلايا المكونة للدم مكمل وطازج طوال فترة الزراعة. قم بتحليل الخلايا وفقاً لبروتوكول النص. بعد تشريح المشيمات من الفئران الحوامل وفقاً لبروتوكول النص، استخدم من 2 إلى 5 ml من collagenase type one بتركيز 0.2% في PBS مع 20% FBS لغسل النسيج، وباستخدام إبرة قياس 18 مثبتة على سرنجة سعة 5 ml، قم بتفكيك النسيج ميكانيكياً في محلول PBS.

يتم تحضين الخلايا المشيمية في 2 إلى 5 مل من محلول الكولاجيناز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة. بعد ذلك، يتم تمرير الخلايا عدة مرات عبر إبر ذات قياس 20 إلى 25 مثبتة على محاقن سعة 5 مل لمزيد من التفكيك الميكانيكي. ثم تُصفى معلقات الخلايا المفردة عبر مصافي خلايا بمسامية 70 ميكرون.

بعد ذلك، قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كريات الدم (hemocytometer)، ثم عرّضها لإشعاع بقوة 2,000 centigray volts لإحداث تعطيل انقسامي. أضف عشرة ملليلترات من وسط استزراع الخلايا المكونة للدم (hematopoietic culture medium) مضافاً إليه المواد التالية في طبق قطرُه عشرة سنتيمترات. ضع مرشحاً بمسامية 0.65 micron مباشرة فوق وسط الاستزراع في الطبق، واتركه يطفو لإنشاء واجهة سائلة-غازية، ثم ضع الطبق جانباً.

قم بفصل الخلايا الليفية الجنينية (MEFs) المنقولة في اليوم 25 كما تم توضيحه سابقاً في هذا الفيديو، واخلط 33,000 من هذه الخلايا المنقولة مع 167,000 خلية من التجمعات المشيمية المعطلة انقسامياً. ولتكوين التجمع، قم بطرد خليط الخلايا الليفية الجنينية والخلايا المشيمية مركزياً عند 300 ×g لمدة خمس دقائق. اشفط الوسط واستخدم من 30 إلى 50 µL من وسط DMEM القياسي لإعادة تعليق الخلايا المترسبة، ثم اسحب معلق الخلايا المفردة في طرف ماصة غير مدبب سعة 200 µL.

بعد ذلك، قم بسد طرف الماصة باستخدام غشاء البرافين. ثم، ضع الطرف المسدود في أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter وقم بدورانه بسرعة 300 ×g لمدة خمس دقائق حتى تتكون كتلة (pellet) عند الطرف المغطى من الماصة. انزع الطرف بعناية من أنبوب الـ 15 milliliter وثبته على نهاية ماصة P200.

تخلص من غشاء البارافين وادفع كتلة الخلايا فوق المرشح العائم في طبق وسط الزرع. ازرع التجمعات على المرشحات العائمة عند 37 درجة Celsius و5% من carbon dioxide لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام. وباستخدام كاشطة خلايا، اجمع التجمعات ثم ادمجها واستخدم 0.5% من collagenase لهضمها.

بعد عملية التفكيك، استخدم من ملي لترين إلى خمسة ملي لترات من PBS مع 5% FBS لغسل التجمعات، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 ×g لمدة خمس دقائق. أعد تعليق التجمعات في 500 µL من DMEM الخالي من FBS و Pen-Strep و L-glutamine. أضف المعلق بالكامل إلى ثلاثة ملي لترات من وسط ميثيل سلولوز بتركيز 1% مدعم بـ 10 ng/mL من Tepo، مع توخي الحذر لتجنب تكون الفقاعات.

قم بتوزيع أحجام متساوية من هذا الخليط في ثلاثة أطباق زراعة غير معالجة بحجم 35 × 10 مليمتر لإجراء مقايسات CFU. وكعينة ضابطة، قم بزراعة تجمعات مشيمية مشععة. وأخيراً، قم بعدّ المستعمرات المكونة للدم يدوياً تحت المجهر بعد فترة زراعة تتراوح من 10 إلى 14 يوماً عند درجة حرارة 37 °C مع 5 % من ثاني أكسيد الكربون.

في عملية إعادة برمجة الخلايا الليفية الجنينية للفئران (MEFs) إلى خلايا جذعية مكونة للدم (HSCs)، يتم نقل عوامل النسخ إلى الخلايا كما هو موضح هنا. وبعد ثلاثة أيام من التوسيع والتعرض لـ DOX لبدء تنشيط الجين المنقول، يتم تفكيك الخلايا وتقسيمها وزراعتها على أطباق مطلية بالجيلاتين وفي وسط دموي تكميلي. وفي اليوم 20 من الزراعة، وبعد النقل باستخدام وسط إعادة البرمجة، تظهر خلايا 34/H2BGFP MEFs تغيرات مورفولوجية واضحة تشمل مورفولوجيا بطانية متميزة عن خلايا MEFs.

تؤدي الاستزراع الإضافي حتى اليوم 35 إلى ظهور عدة خلايا مستديرة شبيهة بالخلايا المكونة للدم تنبثق من الوسائط الشبيهة بالخلايا البطانية، وتكون هذه الخلايا موجبة لـ GFP وتظهر صبغاً موجباً للمؤشرات المكونة للدم Sca1 و CD45. وينتج عن الاستزراع الإضافي خلايا تعبر عن CD45 مع الحفاظ على تعبير مراسل CD34 البشري. وعند التجميع المشيمي، تكتسب الخلايا المستزرعة قدرة استنساخية وتنتج مستعمرات في ميثيل السليلوز تحتوي على مورفولوجيات دموية متنوعة وخلايا شبيهة بالأرومات.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أداء كل قسم ببطء لتجنب حدوث أي خلط. سيكون من الصعب ملاحظة أي أخطاء إلا بعد مرور أسابيع من بدء عملية إعادة البرمجة. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن إجراء طرق أخرى مثل اختبارات الخلايا المكونة لحجارة الرصف (cobblestone-forming cell assays) واختبارات الخلايا البادئة للزراعة طويلة الأمد، وذلك للإجابة على تساؤلات إضافية، مثل ما إذا كانت الخلايا المشتقة تمتلك بالفعل وظيفة تكوين الدم كما تم إثباته في الاختبارات الوظيفية.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال برمجة الخلايا الجذعية المكونة للدم لاستكشاف استراتيجيات إعادة برمجة أخرى وبروتوكولات تحسين في خلايا الدم والخلايا البطانية وأنواع الخلايا الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز برنامج مكون للدم في الخلايا الليفية للفئران، والإفراط في تعبير عوامل النسخ، وكيفية إجراء مقايسة وظيفية للخلايا المشتقة. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.