تدفق الفرز وإكسوم التسلسل من خلايا ريد-ستيرنبرغ من الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل وتركيز خلايا هودجكين ريد ستيرنبرغ أو HRS القابلة للحياة من سرطان الغدد الليمفاوية الليمفاوية الكلاسيكي الالتهابي أو أورام CHL لتوليد وتحليل بيانات تسلسل الجيل التالي من الإكسوم الكامل عالية الجودة. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا CHR ، بما في ذلك تحديد طفرات المحرك الرئيسية ، وطفرات الهروب المناعي ، وكذلك النظر في التنوع الجيني داخل التصنيف. تنتج هذه التقنية الحمض النووي المشتق من الورم عالي الجودة والنقاء.

تسهيل إنشاء مكتبات تسلسل الجيل التالي دون الحاجة إلى خطوة ما قبل التضخيم. قد يكون لهذه التقنية آثار مهمة في تشخيص سرطان الغدد الليمفاوية هودجكين لأنها قد تساعد في التصنيف الفرعي والتنبؤ. قد يؤثر أيضا على اختيار العلاج ، حيث قد تشير بعض التعديلات إلى الحساسية أو المقاومة لأدوية معينة.

جوناثان فروم أولا لديه هذه الفكرة عندما اكتشف كيفية تصور خلايا HRS عن طريق قياس التدفق الخلوي وإجراء تجارب الفرز الأولى مع هذه الخلايا. قبل تحضير الخلايا ، اخلطي الأجسام المضادة المسبقة في قارورة زجاجية داكنة. بعد ذلك ، أضف PBS و BSA ليصل حجم كوكتيل الأجسام المضادة إلى 100 ميكرولتر.

وانقل القارورة من النيتروجين السائل إلى دلو ثلج أو ثلج جاف. بعد ذلك ، قم بإذابة الخلايا ذات الأهمية بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية. عندما يتبقى جزء صغير فقط من المجمدة ، اسكب الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر يحتوي على 45 مل من وسط ذوبان 37 درجة مئوية ، واشطف القارورة المبردة مرتين بمليلتر واحد من وسط الذوبان الطازج.

بعد تجميع كلتا الشطفتين ، اترك الخلايا تهضم في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. عندما تعيد الخلايا التوازن ، اجمعها عن طريق الطرد المركزي. استنشق كل ما عدا آخر 200 ميكرولتر من المادة الطافية

أعد تعليق الخلايا في وسط الذوبان المتبقي واترك الخلايا ترتاح لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق أخرى. بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا في 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء. في نهاية الحضانة ، اغسل الخلايا في ثلاثة ملليلتر من وسط الفرز ، وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط الفرز الطازج.

بعد ذلك ، قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة علوية لأنبوب التدفق سعة خمسة ملليلتر. شطف الأنبوب والمصفاة بملليلتر إضافي واحد من وسط الفرز ، والاحتفاظ بالخلايا على الجليد. قبل البدء في فرز الخلايا ، في برنامج مقياس التدفق الخلوي ضمن قائمة التجربة ، حدد تجربة جديدة وافتح نافذة حالة الجهاز.

في علامة تبويب المعلمات، احذف أي معلمات غير مستخدمة. بعد ذلك، أعد فتح علامة تبويب التجربة وحدد إعداد التعويض لإنشاء عناصر التحكم في التعويض. في نافذة المستعرض، انقر فوق علامة الجمع لتوسيع عينة التحكم في التعويض، وقم بتشغيل أنابيب التحكم في التعويض دون تسجيل البيانات.

اضبط جهد الكاشف حسب الضرورة بحيث تكون مجموعات الخرزة الملطخة إيجابيا لكل كروم نباتي بين القناة 10 ، 000 و 100 ، 000. ومن ألمع في قناة الكشف الأساسية الخاصة بهم. سجل الفولتية اللازمة لكل معلمة لكل أنبوب.

بعد ذلك ، تحت عينة التحكم في التعويض ، انقر بزر يسار واحد لتسليط الضوء على أنبوب التحكم غير الملوثة وتحميل أنبوب التحكم غير الملوثة على مرحلة العينة. في نافذة التحكم في الاستحواذ ، انقر فوق الحمل ، وقم بتشغيل عناصر التحكم في التعويض الفردي في حقول جهد الكاشف لجميع المعلمات لإدخال الفولتية المحددة يدويا. انقر فوق سجل للحصول على بيانات التحكم غير الملوثة.

ثم قم بتشغيل جميع عناصر التحكم في التعويض المتبقية ، وتسجيل البيانات دون تغيير أي من إعدادات الكاشف. عندما يتم تحليل جميع عناصر التحكم ، قم بتشغيل أنبوب من الماء المعقم منزوع الأيونات لمدة خمس دقائق لتنظيف الجهاز من أي مادة متبقية قبل المتابعة. لبوابة الخلايا لفرز HRS ، قم بتحميل الأنبوب التجريبي وسجل ما لا يقل عن 100،000 حدث مع ضبط معدل التدفق للحصول على 3،000 إلى 4،000 حدث في الثانية.

تأكد من تسجيل أحداث كافية لتصور مجموعة سكانية يمكن أن تصل إلى واحد من كل 1000 خلية. لتحديد عناصر التحكم الجسدية في الخلايا B و T ، قم ببوابة الخلايا الإيجابية CD20 و CD5 على التوالي. عندما يتم ضبط جميع البوابات ، قم بفرز الخلايا إلى أنابيب مخروطية مبردة مسبقا سعة 15 مليلتر تحتوي على سبعة إلى ثمانية ملليلتر من وسط التجميع.

في نهاية الفرز ، انقل مجموعات الخلايا المعزولة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 ملليلتر. وتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي. بعد ذلك ، اغسل الخلايا في مليلتر واحد من PBS الطازج وقم بإزالة المواد الطافية من كل أنبوب ، مع الحرص على عدم إزعاج الكريات الصغيرة.

بعد تضخيم المكتبة وتنظيف حبة النقطة 8X ، يجب ملاحظة توزيع الضوء الطبيعي لأحجام الأجزاء في النطاق المطلوب. تشير المكتبات التي تظهر انحرافات عن هذا الشكل إلى وجود قطعة أثرية ذات وزن جزيئي مرتفع أو منخفض ، ومن الناحية المثالية لا ينبغي تسلسلها. على سبيل المثال ، قد ينتقل ثنائي المحول أحيانا من خلال أول تنظيف لخرزة X المدببة ، ويظهر كذروة حادة تتمحور حول 125 إلى 130 زوجا أساسيا.

في هذه الحالة ، يجب إجراء تنظيف إضافي للحبة X المدببة ، متبوعا بتصور متكرر لتوزيع الحجم لضمان الإزالة الناجحة للثنائي. بعد تعدد الإرسال لأربع عينات لكل حارة ، يمكن تحقيق متوسط عمق تغطية من 50 إلى 100 X عبر الهدف. على الرغم من أن مخططات أرقام النسخ التي تم إنشاؤها من مكتبة نانوغرام واحد قد تؤدي إلى مكاسب وخسائر زائفة لأرقام النسخ.

ما يقرب من 70٪ من حالات سرطان الغدد الليمفاوية هودجكين الكلاسيكي تحمل طفرات B2M و 820 ، و / أو عمليات حذف تبدو مستنسخة ، ويمكن استخدامها لتقدير محتوى الورم النسبي. إذا تم استخدام الخلايا التائية كعناصر تحكم جسدية ، فسيظهر تسلسل HRS مكاسب كبيرة في عدد النسخ في المواضع المقابلة لمواضع مستقبلات الخلايا التائية ألفا ودلتا وبيتا. بالإضافة إلى خسائر كبيرة في مستقبلات الخلايا البائية الثقيلة ، ومواضع سلسلة كابا الخفيفة مع عبء طفري إجمالي يتراوح من 100 إلى 400 طفرة جسدية لكل حالة إكسوم.

بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية بما في ذلك فرز الخلايا وبناء مكتبة التسلسل ، في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكننا إجراء دراسات مستقبلية أكبر وطرق أخرى ، مثل علم التخلق والبروتينات والتمثيل الغذائي لاكتساب المزيد من المعرفة حول سرطان الغدد الليمفاوية هودجكين والتقدم نحو علاجات شخصية أكثر تحديدا. بعد تطويرها ، سمحت لنا الطريقة بدراسة خلايا HRS ذات النقاء العالي بأعداد كبيرة نسبيا.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل خلايا HRS وبدء تحليلها الجيني.