بروتوكول CUBIC يتصور التعبير البروتين في قرار خلية واحدة في كامل الاستعدادات الجلد جبل

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور أنماط تكاثر الخلايا والتعبير عن البروتين على مستوى الخلية المفردة في ثلاثة أبعاد وتقييم تشريح الجلد وأمراضه بدقة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول كيفية تحكم الآليات الخلوية والجزيئية في نمو البشرة وتجديدها وكيف تتزعج هذه الآليات أثناء أمراض الجلد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بروتوكول بسيط تقنيا لتصور الخلايا الفردية في خزعات جلدية كاملة السماكة بثلاثة أبعاد بدقة غير مسبوقة.

تسهل الطريقة أيضا التحقيق في التفاعلات بين البشرة والأدمة في عينات الجلد الكاملة. بشكل عام ، قد يكافح الباحثون الجدد في هذه الطريقة قليلا في تحضير خزعات الجلد المسطحة الصغيرة دون الإضرار ببصيلات الشعر. ستظهر الإجراء بيتي ماكلاريوس ، طالبة دكتوراه في وحدة الأمراض الجلدية التنموية والتجديدية في جامعة نيو ساوث ويلز أستراليا.

ابدأ باستخدام أدوات التشذيب لحلق الشعر من عنق الفأر القتل الرحيم مع الحرص على عدم جرح الجلد. ثم تطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول و PBS. بعد ذلك ، ارفع جلد الرقبة الظهرية بالملقط واستخدم المقص لإزالة مساحة 1.5 × 4 سم تقريبا من جلد الفأر الظهري.

ثم قم بتسطيح جانب أدمة الجلد لأسفل على قطعة من ورق الترشيح مع ملاحظة الاتجاه الخلفي الأمامي للعينة وقص الورق حول الجلد المقطع. للحصول على التصوير الأمثل ، يجب أن تظل عينات الجلد مسطحة مع اتجاه ثابت لبصيلات الشعر. للحفاظ على العينات في الوضع الخلفي الأمامي المناسب ، نقوم بإصلاح قطع الجلد على ورق الترشيح في خزعات مستطيلة.

انقل العينات إلى أنبوب سعة 15 مل مملوء ب 4٪ PFA و PBS المحضر حديثا. ثم عندما يتم تثبيتها بإحكام على ورق الترشيح ، انقل العينات إلى أنبوب جديد سعة 15 مل من PBS لمدة غسلتين لمدة خمس دقائق. لتنظيف خزعات الجلد ، بعد الغسيل الثاني ، استخدم شفرة حلاقة حادة لتقطيع الأنسجة إلى قطع 0.2 × 0.5 سم تقريبا مع الحرص على قطع الجوانب الأطول للعينات على طول الاتجاه الخلفي الأمامي للعينات.

القص على طول جانب الخزعة بالتوازي مع اتجاه بصيلات الشعر أيضا على تجنب تلف بصيلات الشعر بشكل كبير. يغمرون الخزعات في 5 مل من محلول مقاصة مكعب واحد محضر حديثا في أنبوب جديد سعة 15 مل ويضعون الأنبوب على منصة دوارة في فرن تهجين عند 37 درجة مئوية. بمجرد أن تصبح قطع المناديل شفافة ، اغسل الخزعات في 4 مل من PBS لمدة أربع غسلات لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية متبوعة بغسل لمدة أربع ساعات و 37 درجة مئوية بوزن 20٪ لكل حجم من السكروز و PBS.

في نهاية الحضانة ، قم بتجميد كل عينة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل في أنابيب فردية سعة 15 مل طوال الليل عند 80 درجة مئوية لزيادة نفاذية الأنسجة لاختراق الأجسام المضادة. في صباح اليوم التالي ، قم بتلطيخ عينات الجلد بالأجسام المضادة المناسبة والأصباغ الحيوية ذات الأهمية. ثم احتضان العينات في 1 مل من محلول المقاصة المكعب المحضر حديثا في أنابيب سعة 2 مل على شاكر لمدة 24 ساعة في فرن 37 درجة مئوية حتى معامل الانكسار للأنسجة.

عندما تكون الأنسجة صافية ، تنزلق الخزعات على طول الجانب الأطول من الغطاء الزجاجي الفردي بحيث يكون اتجاه نمو بصيلات الشعر موازيا لسطح انزلاق الغطاء. ضعي قطرة واحدة من محلول مكعبين على الأنسجة. ضع شريطين بحجم 1 مل × 2 سم من المسمار الأزرق على زلة غطاء ، ثم قم بتغطية الخزعة بقلة غطاء ثانية.

بعد ذلك ، ضع غرفة التصوير على مرحلة المجهر متحد البؤر وانقل الأنسجة إلى مسار الضوء. باستخدام مصدر الضوء المناسب ومرشحات التألق القياسية ، امسح العينة لتحديد المناطق الملطخة بالفلورسنت ذات الأهمية ثم احصل على صور متحد البؤر الفلورية للمناطق ذات الاهتمام. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن توضيح كل من خزعات الجلد الظهرية السماكة للفئران البرية البالغة وتلطيخها بجسم مضاد ضد علامة الخلايا الكيراتينية القاعدية الكيراتين 14.

تظهر النوى الموجبة الداكنة في جميع أنحاء العينة وتسمح بتقدير بعض السمات التشريحية مثل الحليمات الجلدية. يظهر تلطيخ K14 في الطبقة القاعدية السميكة ذات الخلية الواحدة للبشرة بين الجريبات. تحديد الغدد الدهنية وأغلفة الجذر الخارجية لبصيلات الشعر وفي جراثيم الشعر الثانوية مع اكتشاف مستويات منخفضة فقط من تعبير K14 في منطقة انتفاخ بصيلات الشعر.

لتصور الخلايا المتكاثرة ، يمكن توضيح خزعات الجلد الظهرية ذات السماكة الكاملة في التيلوجين للفئران البرية البالغة وتلطيخها كما هو موضح ، مما يكشف عن وجود الخلايا الكيراتينية المتكاثرة في البشرة القاعدية بين البصيلات وفي البرزخ ، ولكن ليس منطقة الانتفاخ في بصيلات الشعر. لتصور الغدد الدهنية ، يمكن توضيح خزعات الجلد الظهرية ذات السماكة الكاملة في مستضد الفئران البرية البالغة وتلطيخها ، مما يسهل اكتشاف الغدد الدهنية في منطقة برزخ بصيلات الشعر. لتصور التغيرات المورفولوجية في البشرة المعدلة وراثيا ، يمكن توضيح خزعات الجلد الظهري ذات السماكة الكاملة وتلطيخها ، مما يكشف عن تضخم البشرة بين الجريبات وبصيلات الشعر غير الطبيعية مع كتل الخلايا المسماة K14 التي تمتد بشكل قريب إلى الأدمة التي تمثل مجموعات الخلايا الجذعية المعدلة وراثيا المتضخمة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لدينا فهم جيد لكيفية تحضير عينات الجلد وتوضيحها وتصور أنماط تعبير البروتين بدقة الخلية المفردة في ثلاثة أبعاد. هذه الطريقة سهلة التنفيذ وتستخدم كواشف آمنة وغير مكلفة نسبيا. في المستقبل ، سيتم اختبار المزيد من الأجسام المضادة للتأكد من توافقها مع هذه الطريقة ، مما يسمح بتوسيع هذا التحليل لتصور المزيد من البروتينات وأنواع معينة من الاهتمام.

يمكن إجراء طرق تصوير أخرى مثل الفحص المجهري للورقة الضوئية لتصور تشريح الجلد وأنماط التعبير عن البروتين لعينات الجلد الكبيرة في ثلاثة أبعاد. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأمراض الجلدية لاستكشاف التفاعلات الخلوية والجزيئية بين الأدمة والبشرة في توازن الجلد ، في نماذج الفئران المعدلة وراثيا وفي أحد نماذجنا للأمراض الجلدية.