تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

الهدف العام من هذه التجربة هو إجراء تنميط جيني سريع ودقيق للأسماك المنتفخة السامة من خلال تحليل مكبرات الصوت الصغيرة PCR. يختلف الجزء الصالح للأكل من الأسماك المنتفخة المستخدمة في تحضير طبق السمك المنتفخ باختلاف أنواعه وتحتوي بعض الأنواع على سموم في جميع أنحاء الجسم. يمكن أن تساعد هذه العضلة وقاعدة البيانات وماسو والزعانف والجلد الخلوي للأسماك المنتفخة في التنميط الجيني للأسماك المنتفخة من وجهة نظر الغذاء الآمن الكامل للجميع وللتحقيق.

لإجراء استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة ، ضع أولا 30 إلى 50 ملليغرام من أنسجة الأسماك في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 أو 1.5 ملليلتر. اسحق الأنسجة بدون زعنفة وجلد باستخدام ملعقة دقيقة. أضف 180 ميكرولترا من محلول تحلل الأنسجة الحيوانية و 40 ميكرولترا من البروتيناز k والدوامة لفترة وجيزة.

احتضن عند 56 درجة مئوية على سخان كتلة لمدة ساعتين أو بين عشية وضحاها. الطرد المركزي العينة لمدة خمس دقائق عند 13000xg. بعد نقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مليلتر ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت الفوضوي الذي يحتوي على هيدروكلوريد الجوانيدين من المجموعة.

ثم أضف 200 ميكرولتر من 99.5٪ من الإيثانول واخلطها عن طريق الدوامة. انقل الخليط ، بما في ذلك أي راسب ، إلى عمود الدوران الموجود في أنبوب تجميع سعة ملليلتر. بعد الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 13000xg ، تخلص من التدفق.

أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل العازل الأول ، الذي يحتوي على هيدروكلوريد الجوانيدين من المجموعة ، وجهاز الطرد المركزي كما كان من قبل. تخلص من التدفق وأنبوب التجميع. ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع جديد سعة ملليلتر مرفق مع المجموعة.

أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المخزن المؤقت الثاني وجهاز الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق عند 20 ، 000xg. بعد التخلص من التدفق من خلال وأنبوب التجميع ، قم بنقل عمود الدوران إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر. ماصة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف إلى مركز غشاء عمود الدوران.

بعد دقيقة واحدة ، جهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 6000xg. ثم ماصة 50 ميكرولترا من ألويت إلى كوفيت فوق بنفسجي يمكن التخلص منه. قم بقياس الطيف فوق البنفسجي للألويت من 220 إلى 300 نانومتر والامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.

يعد استخدام الكاشف الخالي من المنظفات أمرا بالغ الأهمية لنجاح الكروماتوغرافيا السائلة لأن الكاشف يسبب بالفعل ضررا محتملا للعمود التحليلي. العمل على مقعد نظيف لتجنب التلوث ، قم بإعداد 25 ميكرولتر PCR لكل عينة من الحمض النووي المستخرجة ، وتحكم إيجابي وتحكم سلبي ، على الجليد كما هو موضح في بروتوكول النص. لسهولة التشغيل ، اصنع كمية كافية من الكوكتيل الذي يحتوي على جميع الكواشف بدون قالب الحمض النووي واستغني عنه.

استخدم بوليميراز الحمض النووي الذي يحتوي على نشاط تدقيق لغوي لتجنب إضافة ثلاثة أجزاء متدلية من الأدينين الرئيسي إلى منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). تنفيذ تضخيم PCR على جهاز تدوير حراري باستخدام برنامج الدورة الموضح في بروتوكول النص. لإجراء عملية الهضم الأنزيمي ، أضف ميكرولترين من مخزن الهضم الأنزيمي إلى محلول تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

أضف ميكرولتر واحد من كل إنزيم تقييد واخلطه برفق. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في المدورة الحرارية ، تليها خمس دقائق عند 72 درجة مئوية. قم بتصفية محلول التفاعل باستخدام جهاز مرشح طرد مركزي من 0.2 إلى 0.5 ميكرون لمنع الانسداد وتجنب إتلاف العمود التحليلي.

انقل المرشح إلى قارورة بولي بروبلين مدببة واحفظه على حرارة 20 درجة مئوية حتى التحليل. قم بإعداد محلول سداسي فلورو إيزوبروبانول وثلاثي إيثيل أمين في زجاجة سعة لتر واحد كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتوصيل الزجاجة بالخط A من أداة الكروماتوغرافيا السائلة ، وتبريد الزجاجة باستخدام ثلاجة محمولة للتبريد المباشر لمنع التبخر.

قم بتوصيل زجاجة أخرى مملوءة بالميثانول بالخط B.قم بتوصيل عمود الحماية والعمود التحليلي بالأداة. ابدأ في تدفق المرحلة المتنقلة الأولية لموازنة الأعمدة. إذا كنت تستخدم مطياف الكتلة بدون برنامج للتحكم في ضغط C-Trap ، فأنت مطالب بتقليل ضغط C-Trap عن طريق التحكم يدويا في الشريط.

للقيام بذلك ، اسحب المقبض لفتح القفل ، وأدر المقبض عكس اتجاه عقارب الساعة ببطء شديد لتقليل ضغط الفراغ العالي إلى 1/3. يجب أن يتغير الضغط المشار إليه تدريجيا بطريقة متأخرة. تجاهل رسالة التحذير حول الضغط المنخفض.

ادفع المقبض للقفل. بعد إعداد المعايرة ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، حرك مسبار التأين بالرش الكهربائي المسخن بالقرب من واجهة مطياف الكتلة في الموضع B.قم بتوصيل المسبار والحقنة بأنبوب. قم بنقع الطايرة باستمرار بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة باستخدام مضخة الحقنة المدمجة.

تحقق فقط من أيونات الكتلة الستة المنخفضة في جدول المعايرة المخصص. تابع المعايرة بعد استقرار شدة الإشارات. بعد المعايرة ، تحقق فقط من الأيونات الستة ذات الكتلة الأعلى واستمر في المعايرة.

تجنب المعايرة باستخدام جميع الأيونات مرة واحدة لتجنب الفشل. انقل المسبار إلى الموضع D للحصول على معدل تدفق يبلغ 0.4 مل في الدقيقة وقم بتوصيله بالجهاز بأنبوب معدني خامل. بعد إعداد المعلمات كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإزالة الفقاعات من خلال النقر على قيعان القوارير.

اضبط قوارير العينة على رف العينة وقم بحقن ميكرولتر واحد من العينة باستخدام جهاز أخذ العينات التلقائي لبدء التحليل. افتح ملفات البيانات الأولية باستخدام برنامج متصفح وتأكد من انتهاء جميع عمليات الاستحواذ بنجاح ، بما في ذلك عناصر التحكم الإيجابية والسلبية. قم بإعداد طريقة كما هو موضح في بروتوكول النص ثم انقر فوق الزر تشغيل في علامة التبويب تشغيل التلميح لبدء تشغيل برنامج التفكيك.

بعد اكتمال الإشارة ، حدد صفا وانقر فوق فتح النتيجة في التسمية التوضيحية العلوية للحصول على نتائج التفكيك. فيما يلي مخطط كروماتوماتوغرام تيار أيوني نموذجي تم الحصول عليه من عنصر تحكم سلبي وعينة سمكة منتفخة. تمثل كل ذروة ازدواج الحمض النووي الذي يتم فصله بناء على طوله.

في هذا المثال ، لوحظت ثلاث قمم من عينة الأسماك المنتفخة. هذه القمم هي نتائج هضم أمبليكون باستخدام اثنين من نوكليازات داخلية. لم يتم ملاحظة أي قمم في عينة التحكم السلبية.

تمثل كل ذروة طيفا كتليا يتكون من أيونات مشحونة مضاعفة. يتيح توسيع الطيف الكتلي ملاحظة العشرات من القمم التي تم حلها نظيريا. هذه الدقة ضرورية لتحديد الكتلة أحادية النظير ولا يمكن تحقيقها إلا من خلال مطياف كتلة عالي الدقة.

في هذا المثال ، الكتل أحادية النظير للقمة الثالثة هي 16296.7656 و 16468.6616 دالتون. بالنظر إلى تفاوت الكتلة البالغ ثلاثة جزء في المليون ، فإن القيم المقاسة متطابقة مع القيم النظرية لروبريب تاكيفوجو كما هو موضح هنا. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في يوم واحد باستخدام الأدوات والأجهزة الشائعة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل الأمبليكونات الصغيرة عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة ، وقياس الطيف الكتلي عالي الدقة للتنميط الجيني. يمكن تطبيق التقنية في تحليل تعدد أشكال الحمض النووي الأخرى بشرط أن ينعكس تباين التسلسل في الأمبليكونات الصغيرة المراد تحليلها. ومع ذلك ، تحدد هذه التقنية التراكيب الأساسية فقط ، ولا يمكن تمييز استبدال القاعدة داخل نفس المركير.