مفهوم TERROIR تفسر من خلال العنب بيري الايض وTranscriptomics

الهدف العام من هذه الإجراءات التجريبية هو ملاحظة بصمات "التروار" (الخصائص البيئية والمكانية) المختلفة في الميتابولوم والترانسكريبتوم لثمار صنف كرمة Corvina. تضمنت دراسة الحالة الموصوفة هنا جمع وتحليل عينات في ثلاث مراحل من النضج من سبع مزارع كرمات موزعة على ثلاث مناطق كبرى على مدار ثلاثة مواسم نمو. وتكشف التقنيات الموصوفة عن التأثير السائد للنضج في الموسم الزراعي على ميتابولوم الثمار.

كما تم تحديد بصمات كيميائية محددة وواضحة تمثل المناطق الكبرى الثلاث في الثمار الناضجة. وقد كُشف عن بصمة المنشأ (terroir) على مستوى المنطقة الكبرى باستخدام تقنيات إحصائية مناسبة مثل تحليل المكونات الرئيسية (PCA)، والتحليل التمييزي المربعي المتعامد ثنائي الاتجاه (auto BLSDA)، وذلك لتحليل مصفوفة بيانات كل من النسخ المتماثل (transcriptomics) والأيضيات (metabalomics). ومن ناحية أخرى، فإن الاختلافات بين الكروم الفردية تكون أكثر دقة، وتتطلب أيضاً مناهج إحصائية أكثر تطوراً وحساسية.

ابدأ التجربة بوضع خطة أخذ عينات مناسبة. تأكد من أن خطة أخذ العينات تحدد أماكن وأوقات أخذ العينات وإجراءات أخذ العينات الدقيقة. بعد حصاد 30 عنقوداً من مواضع مختلفة على طول صفين من الكروم، اختر ثلاث ثمرات عشوائياً من كل عنقود، مع تجنب الثمرات التي بها تلف مرئي أو علامات عدوى.

كرر هذه العملية للحصول على ثلاث مجموعات مستقلة لكل مرحلة من مراحل النضج. قم بإزالة البذور من الثمار، وجمد الغلاف الثمري فوراً في النيتروجين السائل. اطحن جميع الثمار المجمدة من كل مجموعة باستخدام طاحنة آلية.

قسّم كل عينة مسحوقة إلى جزأين متساويين، أحدهما لتحليل الترانسكريبتوميات، والآخر لتحليل الميتابولوميات. بعد ذلك، أغلق وأزل المطحنة، وخزّن المساحيق عند درجة حرارة -80 °C. قم بتحضير المستخلصات الميتابولومية لعينات التوت في درجة حرارة الغرفة في ثلاثة أحجام من الميثانول، المحمض بـ 0.1% formic acid، في حمام موجات فوق صوتية بتردد 40 kHz لمدة 15 دقيقة.

قم بطرد المستخلصات مركزياً عند 16,000 ×g لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. خفف الراشح في حجمين من الماء منزوع الأيونات، ثم مرره عبر مرشح 0.2 ميكرون. قم بإعداد جهاز الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء المقترن بمطياف الكتلة، باستخدام مصدر تأين بالرش الإلكتروني أو نظام HPLC-ESI-MS، كما هو موضح في البروتوكول النصي.

قم بإجراء عملية الفصل باستخدام تقنية HPLC بتدرج خطي من المذيبين A وB وبمعدل تدفق ثابت قدره 0.2 milliliters per minute، وباستخدام حجم حقن للعينة يبلغ 30 microliters. قم بجمع أطياف الكتلة في أوضاع تأين سالبة وموجبة بالتناوب، وفقاً للمعايير المدرجة في البروتوكول النصي. ولمعالجة بيانات LCMS، قم بتنفيذ إجراءات محاذاة اكتشاف القمم، وملء الفجوات، وترشيح القمم باستخدام برنامج مناسب، مثل البرنامج مفتوح المصدر M Zeta Mine، الإصدار 2.14.

قم باستيراد ملفات النصوص الناتجة إلى جدول بيانات. سينتج عن ذلك مصفوفة بيانات يتم فيها تقدير كمية جميع المستقلبات المكتشفة - والتي يتم التعرف عليها من خلال رقم تعريف، وقيمة نسبة الكتلة إلى الشحنة، ووقت الاستبقاء - في جميع العينات بدلالة قيم مساحة الذروة. قم بتجهيز تجميع التهجين بناءً على مواصفات تنسيق الحزمة الرباعية، وذلك بوضع 1.65 micrograms من RNA المتمم المسمى بالسيانين، في حجم نهائي قدره 41.8 microliters من الماء منزوع الأيونات والخالي من RNAse.

أضف 11 µL من عامل الحجب (blocking agent) بتركيز 10X، و 2.2 µL من منظم التجزئة (fragmentation buffer) بتركيز 25X. يتم التحضين عند 60 °C لمدة 30 دقيقة في حمام حراري لتجزئة RNA. بعد مرور 30 دقيقة، يتم التبريد فوراً على الثلج لمدة دقيقة واحدة.

أخيرًا، أضف 55 µL من محلول التلقيح المنظم (hybridization buffer) بتركيز 2X، واخلط جيداً باستخدام الماصة. بعد عملية الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 15,500 ×g في درجة حرارة الغرفة، ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق فوراً على الثلج. ولتحميل المصفوفة الدقيقة المخصصة، قم بتحميل شريحة الحاشية بحيث يكون الملصق موجهاً للأعلى في قاعدة غرفة التلقيح.

قم بتحميل 100 µL من عينة التهجين ببطء في كل بئر من آبار الحشية، مع توزيع السائل باستخدام طرف الماصة وتجنب تكون الفقاعات. ضع مصفوفة ميكروية مخصصة ببطء بحيث يكون وجهها للأسفل، مع التأكد من أن الرمز الشريطي الرقمي يتجه للأعلى. تأكد من محاذاة زوج الساندوتش بشكل صحيح.

وأخيرًا، ضع غطاء غرفة التهجين فوق الشرائح المتراصة، وأحكم ربط المشبك يدويًا على الغرفة. قم بتدوير الغرفة المجمعة لتقييم حركة الفقاعات. ضع غرفة الشرائح المجمعة في جهاز تدوير متوازن، داخل فرن تهجين مضبوط على 65 °C.

اضبط جهاز التدوير ليدور بسرعة 10 RPM. اترك عملية التهجين تستمر لمدة 17 ساعة. للمتابعة في غسل شريحة المصفوفة الدقيقة، جهز ثلاثة أطباق لصبغ الشرائح واملأها بمحاليل الغسل المناسبة.

املأ وعاءين بمحلول غسيل 1 في درجة حرارة الغرفة، ووعاءً واحداً بمحلول غسيل 2 مُسخن مسبقاً. قم بتفكيك غرفة التهجين، وأخرج الشريحة المجمعة (sandwich). مع توجيه الرمز الشريطي الرقمي لشريحة المصفوفة الدقيقة (micro-array slide) للأعلى، اغمر الشريحة المجمعة في وعاء صبغ الشرائح الأول المملوء بمحلول غسيل 1 في درجة حرارة الغرفة، وبمساعدة ملقط نظيف، افصل الحاشية (gasket) عن شريحة المصفوفة الدقيقة.

انقل شريحة المصفوفة الدقيقة بسرعة إلى حامل شرائح، وضعها في وعاء صبغ الشرائح الثاني المليء بمحلول الغسل الأول في درجة حرارة الغرفة. ضع وعاء صبغ الشرائح على محرك مغناطيسي، واغسلها لمدة دقيقة واحدة مع التقليب المعتدل. انقل حامل الشرائح بسرعة إلى وعاء صبغ الشرائح الثالث، المليء بمحلول الغسل الثاني المسخن مسبقاً، واغسلها لمدة دقيقة واحدة مع التقليب المعتدل.

أخرج الرف ببطء من وعاء صبغ الشرائح، ثم انزع الشريحة من الرف بعناية، مع تجنب تكون القطرات. ضع شريحة المصفوفة الدقيقة في ماسح ضوئي مناسب، واعمل على مسح كل مصفوفة باستخدام إعدادات المعلمات الموصى بها في دليل تعليمات الشركة المصنعة للمصفوفة الدقيقة. ولتجهيز برنامج التحليل الإحصائي، قم أولاً باستيراد بيانات الميتابولوميات والترانسكريبتوميات.

انتقل إلى قائمة File، ثم New Regular Project، ثم New Regular Project، لاستيراد مصفوفة البيانات التي تم الحصول عليها. بعد ذلك، انقر فوق Edit. قم بإجراء عملية تدوير (Transpose) للمصفوفة بأكملها، ثم home، وخصص المعرفات الأساسية والثانوية (primary and secondary ID) المناسبة. ثم انتهِ.

لإجراء التحليل الإحصائي متعدد المتغيرات، انتقل إلى نافذة مجموعة العمل (Workset)، واختر PCAX كنوع للنموذج، ثم انقر فوق AutoFit. اختر Scores ثم Scatter، لعرض المخطط الذي يوضح التجميع المحتمل للعينات. قم بفحص مخطط درجات PCA.

في حال الحصول على نموذج جيد، استخدم نفس فئات العينات لبناء نموذج تحليل تمييزي O2PLS. لبناء نموذجين لتحليل التمييز O2PLS باستخدام العينات التي صنفها MacroZone، قم بتعيين الفئات من خلال الانتقال إلى نافذة Home، ثم New As، ثم M1، ثم Observations. حدد الفئات المطلوبة.

بعد ذلك، قم بتغيير نوع النموذج من PCAX إلى تحليل التمييز O2PLS. اضغط على Autofit. انتقل إلى اختيار M2 في نافذة المشروع (Project window)، وانقر فوق Scores، ثم Scatter، لعرض المخطط وموضع فئات العينات.

انتقل إلى "Select Data Type"، واختر "Observations and Loadings". ثم انقر على "Add Series"، واختر العناصر "PQ correlation one" و"PQ correlation two"، أو أي مكونات إضافية في حال توفرها. وبالنقر بزر الماوس الأيمن على المخطط، انتقل إلى "Property"، واختر "Color"، ثم اختر "By Terms"، لتمييز رموز المخطط بين الجزيئات والفئات.

انتقل إلى Layout، ثم Format Plot، ثم Access و/أو Styles، لتعديل المخطط بالخصائص المطلوبة. ولملاحظة المستقلبات التي تميز فئة واحدة أو أكثر من الفئات المحددة، انتقل إلى Plot List، ثم Scatter. أظهر التحليل الاستكشافي لمصفوفة البيانات بأكملها باستخدام PCA أن العينات تجمعت وفقاً لمرحلة النضج، بما في ذلك مرحلة veraison، ومنتصف النضج، والنضج الكامل، وذلك على طول المكونين الرئيسيين الأول والثاني.

تجمعت العينات وفقاً لموسم النمو على طول المركبة الرئيسية الثالثة. ويسمح تحليل التمييز O2PLS للتوت الناضج بتحديد بصمات محددة للمنطقة (terroir)، والتي تمثل المناطق الكبرى الثلاث: Valpolicella، وبحيرة Garda، وSoave. وتعبر مخططات التحميل لهذه النماذج عن ارتباط PQ، وهو الارتباط بين P، فئة العينات، وQ، المستقلبات.

في مخططات التحميل، تمثل المربعات الحمراء فئة العينات أو المناطق الكبرى، بينما تمثل المثلثات الملونة المستقلبات الفردية. وقد تم ترميز المستقلبات بالألوان وفقًا لفئتها الكيميائية، وتعكس المسافة بين المستقلبات والعينات طبيعة العلاقات بينهما. وتميزت المنطقة الكبرى لبحيرة غاردا بوجود الستيلبينات، بينما تميزت منطقتا سوافي وفالبوليتشيلا بالفلافونيدات.

ضمن الأنثوسيانينات، كانت البيونيدين ومشتقاته أكثر انتشاراً في المنطقة الكبرى لبحيرة غاردا (Lake Garda)، بينما كانت الأنثوسيانينات الأخرى أكثر انتشاراً في المنطقة الكبرى لفالبوليتشيلا (Valpolicella). علاوة على ذلك، كانت ثلاثي-O-جلوكوزيدات الأنثوسيانين أكثر انتشاراً في المنطقة الكبرى لفالبوليتشيلا، في حين كانت المشتقات المأسلتلة والمكومرة أكثر انتشاراً في المنطقة الكبرى لسوافي (Soave). وتسمح طرق التحليل النسخي (Transcriptomics)، والتحليل الكمي للـ RNA (RA)، والـ RNA-seq بمراقبة الآلاف من نسخ كرمة العنب في وقت واحد.

تم مؤخراً تصميم مصفوفة دقيقة مخصصة جديدة تمثل عدداً أكبر من المجسات، والتي تعبر عن أجناس إضافية مكتشفة حديثاً من الكرمة. ونظراً للتقادم السريع لمنصات تحليل النسخ (transcriptomic platforms)، فقد وصفنا إجراءً بديلاً باستخدام منصة جديدة تحتوي على مجسات أكثر من المنصة القديمة، بما في ذلك 249 نسخة متوقعة إضافية من peno، لـ 1392 موقعاً من peno تم تحديدها حديثاً، و 179 جيناً من corvina prava. ويعد تحليل الميتابولوميات باستخدام HPLC-ESI-MS حساساً بما يكفي للكشف عن أعداد كبيرة من المستقلبات في آن واحد.

تعد القدرة على إنشاء مستوى أخذ عينات أمراً بالغ الأهمية. وقد أتاح اختيار نسخة واحدة لتقليل الاختلافات الجينية، وتعدد فترات أخذ العينات، تحديد الاختلافات الحقيقية بين مناطق التربة (terroirs). وسيكون من المثير للاهتمام مقارنة الصنف ذاته المزروع في مناطق أقل مثالية، ولكن لسوء الحظ، لم تكن هذه الكروم متاحة.