كشف اللونية البصرية من متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال على منصة التلاعب هوائي القطرة

الهدف العام من هذا الإجراء هو الجمع بين طريقة بسيطة للكشف بصريا عن تعدد الأشكال متعدد النيوكليوتيدات مع منصة معالجة القطرات الهوائية. منصة الكشف عن الحمض النووي على سطح مفتوح وهي مباشرة لاستخدامها للباحثين في الكيمياء الحيوية. لقد بحثنا في أداة بسيطة للكشف المتكرر عن الطفرات الجينية والأمراض الوراثية.

لديها إمكانات أكبر تساعدنا على فهم كيف يؤدي التباين الجيني إلى المرض. لقد جمعنا بين طريقتين جديدتين وبسيطتين. يمكن الكشف عن تعدد الأشكال متعدد النيوكليوتيدات على منصة معالجة القطرات الهوائية بالعين المجردة وبدون أي أداة إضافية.

توضيح طريقة الكشف عن تعدد الأشكال متعدد النوكليوتيدات بواسطة Tzu-Ming Wang ، طبيب ما بعد في مجموعتنا. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد محلول 100 ميكرومولار من الحمض النووي للمسبار كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم أضف الحمض النووي للمسبار إلى محلول OD واحد لكل مليلتر من جزيئات الذهب النانوية.

اجعل التركيز النهائي ل SDS إلى 0.01٪ و PBS إلى 0.01 مولار. اترك المحلول يحتضن لمدة 20 دقيقة. بعد ذلك ، قم بزيادة تركيز كلوريد الصوديوم إلى 0.05 مولار عن طريق إضافة محلول مكون من اثنين من كلوريد الصوديوم المولي و 0.01 مولي PBS.

حافظ على تركيز SDS عند 0.01٪ واترك المحلول يحتضن لمدة 20 دقيقة. قم بزيادة تركيز كلوريد الصوديوم بزيادات قدرها 0.1 مولار على فترات 20 دقيقة حتى يتم الوصول إلى التركيز النهائي لمولا واحدا. احتضان المحلول عند 23 درجة مئوية طوال الليل على دوار.

بعد أن تصبح عينات الحمض النووي وجسيمات الذهب النانوية مترافقة ، قم بالطرد المركزي للمحلول عند 7 ، 000 مرة جم لمدة 30 ثانية. قم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، قم بإعداد 25 محلول مسبار نانوي من الجسيمات الذهبية عن طريق تعليق الحبيبات في الماء منزوع الأيونات.

قم بإعداد عينات الحمض النووي المستهدفة كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف ستة ميكرولترات من محلول مسبار الجسيمات النانوية الذهبية إلى كل عينة من الحمض النووي مع كلوريد الصوديوم. باستخدام خلاط دوامة ، رج كل محلول عينة لمدة خمس دقائق عند 23 درجة مئوية.

ثم أضف ستة ميكرولترات من 400 ملليمولر هيدروكسيل أمين وستة ميكرولترات من حمض الكلوروأوريك 25.4 ملليمولار إلى كل محلول عينة من الحمض النووي. ضع هذه العينات جانبا حيث سيحدث تغيير مطرد في اللون خلال الساعة القادمة. يمكن تمييز الحجم والخصائص البصرية المعتمدة على الشكل للجسيم النانوي وعدد عدم التطابق في جزء الحمض النووي النموذجي عن طريق العين.

لبدء تصنيع منصة معالجة القطرات ، استخدم آلة يتم التحكم فيها عدديا بالكمبيوتر ومجهزة بمثقاب 0.5 ملم لإنتاج قوالب رئيسية قائمة على PMMA مع هياكل مجهرية. بالنسبة للحفر ، استخدم سرعة تغذية تبلغ سبعة ملليمترات في الثانية ومعدل دوران يبلغ 26 ، 000 دورة في الدقيقة ، وافحص القوالب بعد الحفر. استخدم منفاخ هواء وماء منزوع الأيونات لتنظيف سطح القوالب الرئيسية وإزالة أي خردة PMMA.

بعد ذلك ، قم بإعداد خليط من 10 إلى واحد من قاعدة PDMS وعامل المعالجة. قم بإزالة الخليط في مجفف حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء. ثم اسكب خليط PDMS في القالب الرئيسي.

اخبزيها لمدة ثلاث ساعات عند 60 درجة مئوية للحصول على الهياكل المجهرية العكسية في غرف الهواء والقنوات الهوائية. بعد اكتمال الخبز ، قم بإزالة طبقة PDMS من القالب الرئيسي ، وقم بعمل ثقوب فيها لمداخل شفط الهواء. استخدم نظام معالجة بلازما الأكسجين لتنظيف غشاء PDMS وطبقة PDMS.

بعد العلاج ، قم بربط غشاء PDMS وطبقة PDMS ، ثم قم بعمل ثقوب في هذا الهيكل المترافق. بعد ذلك ، قم بربط PDMS والركيزة الزجاجية معا باستخدام لوح ساخن عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بمجرد ربط الطبقات ببعضها البعض ، ضع اللوحة المركبة في آلة القطع بالليزر PDMS بحيث يكون جانب الغشاء لأعلى.

قم باستيراد ملف dwg لتحديد المنطقة الكارهة للماء الفائقة ، ولاحظ أنه سيتم نقشها مباشرة في غشاء PDMS. نظف السطح الفائق الكاره للماء المحفور حديثا بالماء منزوع الأيونات. سيؤدي ذلك إلى غسل أي بقايا متفبنة.

بعد تنظيف السطح ، قم بتوصيل مدخل شفط الهواء ومضخة التفريغ من خلال صمام الملف اللولبي. بعد ذلك ، قم بتوصيل صمام الملف اللولبي بجهاز كمبيوتر للتحكم فيه باستخدام وحدة IO USB رقمية. بمجرد إعداد منصة معالجة القطرات الهوائية ، أضف 10 ميكرولترات من 0.5 ميكرومولار من الحمض النووي المستهدف في المنطقة الكارهة للماء.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من محلول مسبار الجسيمات النانوية الذهبية 25 نانومولار المهجن حديثا بجوار قطرة الحمض النووي المستهدفة. استخدم برنامجا بسيطا للتحكم في شفط الهواء إلى المنصة من خلال صمام الملف اللولبي. اضبط الضغط على سالب 80 كيلو باسكال ، وتردد القيادة على خمسة هرتز.

وفر الشفط على طول مسارات اهتزاز القطرة ، مما يتسبب في تصادمها والاندماج. بعد ذلك ، امزج القطرة المجمعة عن طريق التلاعب بالشفط لدحرجة العينة لمدة ثلاث دقائق. أضف ميكرولترين من 400 مللي مولر هيدروكسيلامين ، ولترين ميكرولترين من حمض الكلوروأوريك 25.4 مللي مولار إلى المنطقة الكارهة للماء الفائق لمنصة معالجة القطرات الهوائية.

قم بمعالجة الشفط بحيث تصطدم القطرات وتندمج. ثم اخلطي القطرة المدمجة عن طريق لفها لمدة دقيقة واحدة. راقب لون القطرة النهائية بالعين المجردة.

في هذه الدراسة ، تم الكشف عن تعدد الأشكال متعددة النوكليوتيدات بشكل لوني باستخدام تهجين الحمض النووي بوساطة نمو مجسات الجسيمات النانوية الذهبية. هنا ، تمتلك عينات الحمض النووي صلات مختلفة مع الحمض النووي للمسبار ، مما يتسبب في اختلافات في نمو الجسيمات النانوية الذهبية ، والتي ينظر إليها على أنها تغير في اللون. تحتوي عينة الحمض النووي غير المتطابقة ذات الزوج الأساسي الثلاثة على تهجين أقل من الحمض النووي التكميلي بالكامل ، والذي يمكن اعتباره فروقا ملحوظة في اللون ، خاصة عند التركيزات الأعلى.

الحمض النووي غير المتطابق للقواعد الستة له تقارب تهجين ضعيف مع المسبار ، وبالتالي كان حجم نمو الجسيمات النانوية الذهبية صغيرا. يظهر هذا التحليل اللوني القابل للتكرار عند التلاعب بالعينات عبر منصة شفط هوائية ، حيث يمكن ملاحظة نتائج عدم تطابق الحمض النووي بالعين المجردة بسهولة. بمجرد إتقانها ، يستغرق الإجراء بأكمله أقل من خمس دقائق من إضافة العينة والكاشف حتى نتيجتها ، وهي أسرع بكثير من الطريقة التقليدية.

الإجمالي في كل عملية هو 10 ميكرولتر فقط ، وهو أقل بكثير مما هو مطلوب في نظام كبير. باتباع هذا الإجراء ، بمجرد التأكد من أن تباين التسلسل في مساحة جزء الحمض النووي مسؤول عن مرض معين. يمكن استخدام المنتج المصمم خصيصا للحصول على عدد من عدم تطابق عينة الحمض النووي.

تعتبر منصة معالجة القطرات الهوائية أكثر توافقا حيويا من الطرق الأخرى مثل الترجيح البصري ، والتألق الكهربائي للصبغة ، والترجيح الكهربائي ، والتشغيل الشعري للشومو. تم إجراء طريقة الكشف عن تعدد الأشكال متعددة النوكليوتيدات المقترحة تحت منصة معالجة القطرات الهوائية ، مما يعني أنه يمكن تحميل العينات والكواشف مباشرة وجمعها باستخدام الماصة. بعد تطويرها ، تتمتع هذه التقنية بإمكانات عالية لفحص الحمض النووي والتطبيقات الكيميائية والحيوية الأخرى.